Клъстерните редовно разположени къси палиндромни повторения (CRISPR) са техника за редактиране на генома от трето поколение, която революционизира света със своите високопроизводителни резултати. Тя е използвана за лечение на различни биологични заболявания и инфекции. Различни бактерии и други прокариоти (като археи) също имат CRISPR/Cas9 системи за защита срещу фаги. Съобщава се, че стратегиите, базирани на CRISPR/Cas9, могат да инхибират растежа и прогресията на тройно негативен рак на гърдата (TNBC), като се насочват към потенциално променени гени за резистентност, транскрипция и епигенетична регулация. Тези терапевтични интервенции могат да помогнат за справяне с трудни проблеми като лекарствена резистентност, наблюдавана дори при TNBC. Понастоящем се използват различни методи за доставяне на CRISPR/Cas9 до целевите клетки, като например физически (микроинжектиране, електропорация и хидродинамични режими), вирусни (аденоасоцииран вирус и лентивирус) и невирусни (липозоми и липидни наночастици). )-частици). Въпреки че са разработени различни модели за изучаване на молекулярните причини за TNBC, липсата на чувствителни и целенасочени методи за предоставяне на инструменти за редактиране на генома in vivo ограничава тяхното клинично приложение. В обобщение, този преглед разглежда цялостно напредъка, предизвикателствата, ограниченията и перспективите на лечението с CRISPR/Cas9 за TNBC въз основа на съществуващите доказателства. Също така подчертаваме как комбинацията от изкуствен интелект и машинно обучение може да подобри стратегиите с CRISPR/Cas9 при лечението на TNBC.
Ракът се характеризира с неконтролирано клетъчно делене, нарушаване на контролните точки на клетъчния цикъл и мутации в туморните супресорни гени (TSGs) (Matthews et al., 2022). Сред различните видове рак, ракът на гърдата е най-често срещаният вид рак при жените и има висока смъртност в световен мащаб (Waks and Winer, 2019). Ракът на гърдата е хетерогенно заболяване с разнообразни характеристики, като хистологични и биологични характеристики, клинична картина и поведение, както и отговор на лечението (Weigelt et al., 2010). Класификацията на рака на гърдата предоставя точна информация за диагностиката на рака на гърдата и прогнозата на тумора. Използването на общи биомаркери и клиникопатологични характеристики е основният критерий за класификацията на рака на гърдата (Tsang and Tse, 2019). Прогнозата и отговорът на лечението на рака на гърдата се влияят от множество фактори, включително наличието на естрогенен рецептор (ER), прогестеронов рецептор (PR), рецептор 2 за човешки епидермален растежен фактор (HER2/neu), както и хистологичен клас, вид и клас на тумора, размер и метастази в лимфните възли (Al-Tubaiti, 2020). Идентифицирани са пет присъщи молекулярни подтипа на рак на гърдата, включително луминален А, луминален В, обогатен с HER2, базалноподобен и с ниско съдържание на клаудин (Prat et al., 2015). TNBC е молекулярен подтип на рак, който не експресира всички ER, PR и HER2 (Yin et al., 2020). Тези патологични характеристики са свързани с TNBC, потвърждавайки бързата му прогресия и по-агресивния му характер от всеки друг вид рак на гърдата (Feng et al., 2018). Освен това, Peru et al. (2000) използват технология с микрочипове, за да прекласифицират рака на гърдата и да идентифицират пет присъщи подтипа на рак на гърдата (Cadenas, 2012). Базалноподобният рак на гърдата е подтип на рак на гърдата, който има тройно негативен фенотип и е свързан с бърза прогресия. Трябва да се отбележи, че всички базалноподобни ракови заболявания на гърдата често се диагностицират погрешно като TNBC, но само 77% са TNBC; За разлика от това, 71–91% от TNBC са базалноподобни, което показва, че тези два вида рак на гърдата се припокриват и представляват различни класификации (Wang D.-Y. et al., 2019). Това създава необходимост от характеризиране на хетерогенността на TNBC, за да се изясни прогнозата и да се идентифицират потенциалните отговори на настоящи и бъдещи лечения. Освен това, TNBC представлява 15–20% от всички случаи на рак на гърдата и е по-често срещан при жени под 50-годишна възраст. Мутации в BRCA1 или BRCA2 са докладвани в приблизително 20% от случаите на TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). Проучванията показват също, че TNBC има различна имунна микросреда, която включва високи нива на съдови ендотелни растежни фактори, тумор-асоциирани макрофаги (TAMs), тумор-инфилтриращи лимфоцити (TILs) и други молекули, участващи в растежа и миграцията на тумора. Следователно, разбирането на микросредата на TNBC е от решаващо значение за неговата прогноза и лечение (Fan and He, 2022).
За да се оцени прогнозата на TNBC и да се осигури ефективно лечение, е важна точната диагноза, базирана главно на имунохистохимия (IHC) за откриване на ER, PR и HER2, и мамография за откриване на неоплазми на гърдата. Мамографията обаче не може адекватно да изобрази интратуморни характеристики като некроза и фиброза (Deepak Singh et al., 2021). Тъй като лошата прогноза и диагноза пречат на лекарите да предписват правилните лекарства (Chaudhary, 2020), се използват различни стратегии за подобряване на грижите за пациенти с TNBC. Понастоящем две лекарства, доксорубицин и циклофосфамид, се използват при пациенти с TNBC и са показали добри резултати. Освен това се използват и други платинови лекарства, като карбоплатин и цисплатин (Sikov et al., 2015). В допълнение, PARP инхибитори като Olaparib, Velaparib и PF-01367338 са използвани като потенциални химиотерапевтични лекарства за лечение на TNBC (Ishino et al., 2018). Тъй като е съобщено, че сигналните пътища Wnt/b-Catenin, NOTCH и Hedgehog участват в появата и прогресията на TNBC, насочването на лекарства към тези пътища може да бъде важна стратегия (Aysola et al., 2013). Въпреки че хирургията, лъчетерапията и химиотерапията остават основен метод за лечение на TNBC днес, е постигнат значителен напредък в разработването на нови лечения, включително таргетна терапия, имунотерапия, различни инструменти за генно редактиране, свързани с CRISPR, като Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editing и CRISPR/Cas9-таргетирана генна терапия. Тук ще се съсредоточим върху различни инструменти за генно редактиране, свързани с CRISPR, използвани при лечението на TNBC. Сред тях CRISPR/Cas9 е получил широко внимание.
Cas9n, известен още като Cas9 никаза, е генетично модифициран вариант на протеина Cas9, получен от системата за редактиране на генома CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). В оригиналната си форма протеинът Cas9 съдържа два нуклеазни домена: RuvC и HNH, чиято основна функция е разцепването на двете ДНК вериги. В Cas9n обаче един от нуклеазните домени, HNH, е генетично мутирал и става неактивен. Следователно, HNH домейнът на Cas9n остава нефункционален. Само RuvC домейнът остава активен, което позволява на Cas9n да реже или създава прекъсвания на единични ДНК вериги (Trevino and Zhang, 2014). В сравнение с Cas9, Cas9n може ефективно да намали нецелевите ефекти и точно да подобри механизмите за възстановяване на клетките. Cas9n може да се използва за решаване на различни проблеми, като например създаване на прекъсвания на специфични места в двойноверижна ДНК. За тази цел две молекули Cas9n бяха комбинирани и използвани заедно (Yee, 2016). Смесената линейна киназа 3 (MLK3) е митоген-активирана протеин киназа, която служи като ключов регулатор по време на метастази на TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 може да активира множество сигнални пътища, водещи до метастази на TNBC. Например, пътят на c-Jun N-терминалната киназа (JNK) регулира клетъчната подвижност и разграждането на извънклетъчната матрица, а MLK3 активира JNK пътя, като по този начин засилва клетъчната подвижност и придава инвазивни свойства (Rattanasinchai and Gallo, 2016). MLK3 също така регулира EMT. За да направи това, той активира низходящи транскрипционни фактори като Snail, Slug и Twist. Тези фактори инхибират експресията на епителни маркери и насърчават експресията на мезенхимни маркери, което води до придобиване на метастатичен фенотип (Casalino et al., 2023). Наблюдавано е, че MLK3 играе роля в ремоделирането на извънклетъчната матриксна мембрана (ECM) и активирането на протеази като матриксни металопротеинази (MMPs), които разграждат ECM. Това улеснява инвазията на туморните клетки и разпространението им до отдалечени места (Katari et al., 2019). По този начин, предишни проучвания показват, че MLK3 играе критична роля в TNBC. Ратанасинчай и Гало използваха TNBC модели, за да изследват ролята на MLK3 и установиха, че той насърчава развитието на рак чрез специфични сигнални пътища. Те използваха CRISPR/Cas9n за редактиране на MLK3 и наблюдаваха значително намаляване на метастазите на TNBC (Rattanasinchai and Gallo, 2016).
dCas9, често наричан неактивен Cas9, е модифицирана производна форма на Cas9 протеина. За разлика от активния Cas9, dCas9 няма ендонуклеазна активност, което го прави неспособен да индуцира двойноверижни разкъсвания на ДНК. Следователно, dCas9 може да се използва за прецизно насочване към специфични региони на генома без никакви промени или модификации на ДНК последователността (Wang et al., 2016). В dCas9 два ендонуклеазни протеина, RuvC и HNH, се инактивират чрез потискане на важни аминокиселинни остатъци. (Richter et al., 2016). Въпреки липсата на активност за разцепване на ДНК, dCas9 играе редица важни роли в генетичните изследвания и биотехнологиите. Например, той позволява визуализация на специфични региони на генома, улеснява транскрипционната регулация и насърчава епигенетични модификации (Brocken et al., 2018).
Транскрипционният фактор ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) играе специфична и критична роля в медиирането на епително-мезенхимния преход (EMT), клетъчен процес, който протича по време на ембрионалното развитие, възстановяването на тъканите и прогресията на рака. Той включва трансформацията на епителните клетки в мезенхимни клетки, което води до промени в клетъчната морфология, подвижност, инвазивност и др. (Wu et al., 2020). ZEB1 инхибира множество епителни маркери, като E-cadherin и Occludin, които са отговорни за поддържането на клетъчно-клетъчната адхезия и полярността на епителните клетки при TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). В допълнение, ZEB1 активира определени маркери като N-cadherin, vimentin и фибронектин (Konradi et al., 2014), а също така регулира гени, участващи в цитоскелетното ремоделиране, като Rho GTPases и матриксни металопротеинази (MMPs) (Huang). et al., 2014). 2022), освен това, той влияе и на различни сигнални пътища, като трансформиращ растежен фактор-β (TGF-β), Wnt сигнализация и др., като по този начин насърчава туморната инвазия и метастази при TNBC (Chen et al., 2016). Многобройни проучвания и научни доказателства показват, че ZEB1 има голям потенциал като ценен агент за откриване и терапевтична интервенция на TNBC. В скорошно проучване Waryah et al. използваха TNBC модел и постигнаха пълно потискане на ZEB1 от dCas9. По този начин те наблюдаваха много висока специфичност и почти пълно инхибиране на ZEB1 в in vivo условия (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 е инструмент за редактиране на гени, наречен CRISPR/Cpf1. Той произлиза от системата CRISPR/Cas, където терминът Cas12 се отнася до CRISPR-асоцииран протеин 12 (Bharathkumar et al., 2022), който е напълно подобен на Cas9. Единствената разлика е, че съдържа протеина Cas12. В сравнение с Cas9, Cas12 има някои уникални функции, като например генериране на лепкави краища по време на процеса на редактиране на гени, докато Cas9 генерира тъпи краища (Wang et al., 2021). Това свойство на Cas12 допринася за неговата специфична технология за манипулиране на ДНК. Като протеин, способен прецизно да разпознава и реже целевата ДНК, той има изключителна гъвкавост, което го прави ефективен инструмент за различни приложения, включително редактиране на гени (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019).
Подобно на други варианти на CRISPR, CRISPR/Cas12 е способен да нокаутира или активира гени в TNBC, като се насочва към гени, които играят важна роля в неговата патогенеза или отговор на лечение (Yang and Zhang, 2023). За да се осъществи този процес, е разработена насочваща РНК (gRNA), която насочва Cas12 към целевия ген. След като Cas12 се свърже с целта си, тя въвежда двойноверижни разкъсвания в ДНК и активира механизмите за възстановяване на ДНК. По време на процеса на възстановяване могат да бъдат включени неправилни нуклеотиди, което води до генни мутации и загуба на функция (Zhang et al., 2021a). Освен това, подобрена версия на ензима Cas12 (наречен dCas12) също е използвана за активиране на гени. Чрез комбинирането му с транскрипционен активатор е възможно да се индуцират определени гени, като по този начин се активират. Тази технология има голям потенциал за насърчаване на активирането на туморни супресорни гени (Sultan et al., 2022).
Prime editing е новоразработена и изключително превъзходна технология за редактиране на генома. Тя е способна да модифицира ДНК-то на организма много прецизно (Chen and Liu, 2023). Prime editing се постига чрез интегриране на два основни компонента: модифициран ензим CRISPR/Cas9 и обратна транскриптаза. Ролята на ензима CRISPR/Cas9 е селективно да насочва точни места в генома, докато обратната транскриптаза помага за цялостна модификация на ДНК-то на целевото място (Hassan et al., 2021). В механизма за редактиране на праймери, първата стъпка включва създаването на РНК, водеща за редактиране на праймери (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Тя съдържа целевата последователност и РНК шаблон, съответстващи на желаното място за редактиране в целевата ДНК. След това pegRNA се въвежда в целевите клетки заедно с нуклеаза за редактиране на праймери (PE2). PE2 е фузионен протеин, състоящ се от ензим Cas9, обратна транскриптаза и адаптер за редактиране на праймери (Martín-Alonso et al., 2021). Вътре в клетката, pegRNA и PE2 комплексите търсят специфичната ДНК, която искат да модифицират. Ензимът Cas9 разрязва ДНК и създава шаблон, състоящ се от единични вериги (Choi et al., 2022). Обратната транскриптаза използва този шаблон, за да подготви ДНК за редактиране. Наред с копирането на ДНК, са включени и инструкции за редактиране на РНК шаблона. Накрая, новосъздадената ДНК верига се използва като шаблон за поправяне на прекъсването в ДНК, което води до променена ДНК последователност, съдържаща желаната модификация (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Механизмите за редактиране на праймери могат да доведат до широко разпространени мутации в гените. Те могат да бъдат насочени към точкови мутации, инсерции, делеции и дори генни замествания (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023). Праймерното редактиране предлага няколко предимства пред предишните технологии за редактиране на генома. Те включват повишена точност, намалени странични ефекти и възможност за редактиране на ДНК, без да се разчита на двойноверижни прекъсвания на ДНК (Anzalone et al., 2020).
Технологията CRISPR/Cas9 първоначално е разработена за защита на бактериите от плазмиден трансфер и фагова инфекция, а по-късно е пренасочена като ефективен инструмент за РНК-базирано ДНК таргетиране за редактиране на генома (Jiang and Doudna, 2017). Освен това е съобщено, че системата CRISPR/Cas9 присъства съответно в 50% и 87% от бактериалните и археалните геноми (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 е потенциален инструмент за делеция, вмъкване и коригиране на всяка анормална генетична последователност, използвайки in vivo и in vitro режими (Sabit et al., 2021). Освен това е доказано, че CRISPR/Cas9 е част от адаптивната имунна система поради своята специфичност към целевите гени, представляващи интерес (Chen and Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 се състои от Cas9 и единична насочваща РНК (sgRNA). Cas9 е ендонуклеаза, съставена от множество протеинови компоненти. В допълнение, Cas9 има уникални структурни и конформационни свойства (Pacesa et al., 2022), тъй като се състои от два лоба: разпознаващ (REC) и нуклеазен (NUC). REC лобът е допълнително разделен на три региона: REC1, REC2 и мостови спирали (Cromwell et al., 2018). NUC се състои от три лоба, а именно RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH и домейн за взаимодействие със съседния мотив на протоспейсера (PAM) (фиг. 1) (Song et al., 2016). sgRNA се състои от два компонента, включително CRISPR РНК (crRNA) и транскодираща малка РНК (трасерна РНК) (Фигура 1). sgRNA свързва Cas9 протеина с конексини, за да образува активен комплекс, известен още като ефекторен комплекс (Richter et al., 2012). crRNA е базова двойка от 18–20 нуклеотида, която играе критична роля в разпознаването на целевите ДНК последователности. Освен това, crRNA се сдвоява с целевата ДНК, а tracrRNA действа като скеле за Cas9 нуклеазата, за да се свърже с целевата ДНК (Manghwar et al., 2019). От друга страна, PAM последователността има 3 нуклеотида, което потвърждава, уточнява и медиира свързването на ефекторния комплекс с ДНК. Субединиците RuvC и HNH на Cas9 протеиновия комплекс имат каталитична активност (Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021). HNH нуклеазният домейн на Cas9 субединицата разцепва ДНК веригата, свързана с crRNA. Нуклеазният домейн RuvC разцепва други ДНК вериги и генерира двойноверижни разкъсвания (DSBs), след което се активират два различни механизма за поправяне на ДНК разкъсвания (Jiang and Doudna, 2017) (Фигура 1).
Фигура 1. Общ преглед на CRISPR/Cas9 (A). Компоненти на системата CRISPR/Cas9: (i). Cas9 ендонуклеазата е отговорна за разрязването на целевата ДНК последователност, (ii) единична насочваща (sg) РНК, получена от сливането на crRNA и tra-crRNA химери. (два). Cas9 включва няколко компонента като Rec I, Rec II, NUC лоб (HNH и Ruv C са подкомпоненти) и PAM интеракционен домейн (C) със съответните функции. Протеиновият комплекс CRISPR/Cas9 разцепва ДНК последователностите в некомплементарни и комплементарни форми (D). CRISPR/Cas9 редактира генома на три етапа: разпознаване, разрязване и поправка. Проектираната sg-РНК насочва Cas9 и разпознава желаната последователност чрез комплементарния компонент crRNA. Cas9 разпознава PAM последователността при 5′-NGG-3′ и разтопява ДНК, образувайки ДНК-РНК хибрид и активирайки разцепването. HNH домейнът на Cas9 разцепва комплементарната верига, а RuvC домейнът разцепва некомплементарната верига. CRISPR/Cas9 поправя двуверижна ДНК (dsDNA), като я разкъсва по два начина: нехомоложно свързване на краищата (NHEJ) и хомологично насочена поправка (HDR). NHEJ поправя двуверижна ДНК при липса на чужда хомоложна ДНК чрез ензимен процес, механизъм, склонен към грешки, който може да вмъква или премахва произволни ДНК последователности. HDR е много специфичен и изисква хомоложни ДНК шаблони.
CRISPR/Cas9-медиираните пътища за възстановяване включват механизми за нехомоложно свързване на краищата (NHEJ) и хомологично насочено възстановяване (HDR). NHEJ е път, склонен към грешки, тъй като включва вмъкване или делеция и не изисква никакъв модел по време на механизма за възстановяване. Той използва произволни нуклеотиди за генериране на стандартни протеини (Abbasi et al., 2021). Тази система за възстановяване се състои от четири комплекса, като KU комплекса, кръстосано допълващия се протеинов комплекс тип 4 (XRCC-4), ензима за обработка на ДНК краищата и протеин киназата DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Комплексният протеин KU има две субединици, Ku 70 и Ku 80, и играе важна роля в механизма на NHEJ, тъй като механизмът на възстановяване се инициира от свързването на две субединици (Ku 70 и Ku 80) към тъпите или почти тъпи краища на целевата ДНК (Abbasi et al., 2021), служейки като скеле за набиране на други фактори, свързани с NHEJ, към мястото на увреждане (Yang et al., 2020). XRCC-4 и ДНК лигазата са съставени съответно от 334 и 911 аминокиселини, а комплексът XRCC4-ДНК лигаза IV стимулира лигирането на ДНК краищата (Chatterjee et al., 2015). Ензимът за обработка на ДНК краищата, известен също като полинуклеотид киназа 3′-фосфат, е ензим за обработка на ДНК краищата. Той може да премахне 3′P групата в ДНК и да фосфорилира 5′OH групата по време на възстановяването на DSB. Това включва и поправка на едноверижни разкъсвания (SSBs), използвайки пътя за поправка на SSB (Chatterjee et al., 2015). Протеин киназата DNA-PKcs е ДНК-зависима протеин киназа, която се състои от каталитична субединица на семейството PIKKs (фосфатидилинозитол 3-киназа-свързани кинази) и атаксия телеангиектазия мутирани (ATM), както и ATM и Rad3-свързани ATRs, верижни разкъсвания (DSBs) и едноверижни разкъсвания (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR е по-точен и подходящ механизъм за поправка, тъй като информацията се копира, използвайки непокътнатата форма на хомоложния ДНК дуплекс, въпреки че изисква наличието на сестрински хроматиди. Това се случва по време на S/G2 фазата на клетъчния цикъл на бозайниците. HDR се среща главно при видове дрожди, но NHEJ е от решаващо значение при бозайниците (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Пълният механизъм за поправка е показан на Фигура 1.
Тъй като TNBC се причинява от генетични и епигенетични аномалии, коригирането на злокачествени геномни/епигеномни аномалии с помощта на CRISPR/Cas9 може да бъде разумен терапевтичен подход (Chen et al., 2019). Освен това, някои транскрипционни фактори, участващи в клетъчно-специфичната транскрипционна регулация, могат да проявяват уникални характеристики на раковите клетки, което предполага, че транскрипционната регулация може да бъде отличен подход за лечение на рак (Drost et al., 2017). Използването на тези молекулярни характеристики на туморите, като генетични, епигенетични и транскрипционни дефекти, за разработване на лекарства може да подобри клиничните резултати и да намали разходите за скрининг. CRISPR е потенциален инструмент за редактиране на гени, който може не само да открива и идентифицира геномни мишени, причиняващи рак, но може да се използва и за редактиране, потискане и епигенетично модифициране на онкогени в човешки клетки (Таблица 1) (Ahmed et al., 2021). Проведени са няколко CRISPR скрининга за търсене на гени, свързани с туморни супресори, онкогени и лекарствена резистентност. Използването на CRISPR/Cas9 за редактиране на различни онкогени на TNBC е показано на Фигура 2.
Фигура 2. Генно редактиране на различни онкогени на TNBC, използвайки CRISPR/Cas9, водещо до намален растеж на тумора и метастази. Тези онкогени включват CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 и CXCR7, Crypto1, ROR1 и ST8SIA, които участват в появата и метастазите на TNBC.
Миграцията, инвазията и епително-мезенхимният преход (ЕМТ) на раковите клетки са свързани с ITGA9. Предишни проучвания показват, че ITGA9 е ключов играч в Notch пътя и играе интересна роля в метастазите на рабдомиосаркома (Molist et al., 2020). Освен това е установено, че ITGA9 е тясно свързан с прогнозата на пациентите при няколко вида тумори, включително рак на гърдата (Wang Z. et al., 2019). В допълнение, биоинформатичният анализ на ITGA9 показа, че неговата експресия в TNBC е значително по-висока, отколкото при други подтипове рак на гърдата. Повишените нива на ITGA9 са свързани с туморни метастази и рецидив при пациенти с TNBC. Нокаутирането на ITGA9 чрез CRISPR/Cas9 води до свойства, подобни на раковите стволови клетки (CSC), туморна ангиогенеза, туморен растеж и намалени метастази чрез насърчаване на разграждането на β-катенин в TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Крипто-1 е член на семейството TGF-β и е от решаващо значение за ранната ембриогенеза, поддържането на стволови клетки и метастазите на рака (Ishii et al., 2021). Известен също като Tdgf-1, той е онкогенен GPI-закотвен сигнален протеин, участващ в регулирането на образуването на примитивната ивица, мезодерма и ендодерма, както и в установяването на лява/дясна асиметрия в развитието на телесните органи по време на ембриогенезата (Zhang et al., 2021b). Освен това е доказано, че Cripto-1 участва в епително-мезенхимния преход (EMT) като маркер на стволови клетки (Zhang et al., 2021b). EMT е от решаващо значение не само за различни процеси като ембрионално развитие, фиброза и заздравяване на рани, но и за инвазията и метастазите на рака. Освен това е доказано, че Cripto-1 взаимодейства с четири Notch рецептора и усилва тяхното посттранслационно съзряване (Brandstadter and Maillard, 2019). Известно е, че сигналният път Notch участва в поддържането на човешките ракови клетки на гърдата. Проучвания показват, че CRISPR/Cas9-медиираното нокаутиране на Crypto-1 потиска растежа и метастазите на рака. Следователно, Crypto-1 може да се превърне във важна терапевтична цел за TNBC (Castro et al., 2015).
Протеинът XCL12 и неговият хемокинов рецептор CXC (CXCR4 и CXCR7) играят различни роли в пролиферацията, растежа, миграцията и инвазията на раковите клетки (Wu et al., 2015). Тези хеморецептори са свързани с развитието на TNBC чрез множество сигнални пътища както в in vivo, така и в in vitro модели (Wu et al., 2015). Освен това, активирането на CXCR4 и CXCR7 е свързано с по-голяма податливост към метастази и лоша прогноза при TNBC (Karn et al., 2022). Следователно, нокаутът на CXCR4 и CXCR7 може да се превърнат в ефективни гени-мишени за лечение на рак на гърдата, включително TNBC. Проучване от Yang et al. Yang et al (2019) използваха CRISPR/Cas9 за ко-нокаутиране на гените CXCR4 и CXCR7 и установиха, че пролиферацията, растежът, миграцията и инвазията на TNBC са значително инхибирани (Yang et al., 2019).
Повишени нива на miR-3662, онкоген на TNBC, са наблюдавани в тъканите на рака на гърдата (Yi et al., 2022). Доказано е, че нокдаунът на miR-3662 инхибира растежа и метастазите на тумора на рака на гърдата както in vivo, така и in vitro (Agarwal and Gupta, 2021). HBP-1 е мощен инхибитор на Wnt/-катениновата сигнализация и вероятно е отговорен за miR-3662-медиирания растеж на TNBC клетки. Наскоро Yi et al. откриха, че оста miR-3662-HBP1 регулира Wnt/-катениновата сигнализация в TNBC клетки (Yi et al., 2022). Поради своята тумор-специфична експресия, miR-3662 може да бъде потенциална терапевтична цел за TNBC. По този начин, CRISPR/Cas9-медиираното нокдаун на miR-3662 може да бъде отличен подход за разработване на нови лекарства за лечение на TNBC.
UBR5 е 300 kDa нуклеофосфопротеин, който е идентифициран като ключов регулатор на туморогенезата, метастазите и имунния отговор при различни видове рак (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Съобщава се, че UBR5 е силно повишен в проби от TNBC и стимулира ERα функцията чрез индуциране на пролиферация чрез своята убиквитин лигазна активност (Bolt et al., 2015). Проучвания за секвениране на целия екзом на първични TNBC проби също показват повишена експресия на UBR5, което предполага неговата роля в развитието на TNBC. Освен това, CRISPR/Cas9-индуцираната делеция на UBR5 показва значително инхибиране на метастазите и растежа на TNBC в експериментални миши модели. Освен това, включването на UBR5 в миши модел от див тип възстановява пълната му функционалност, докато този ефект не се наблюдава при инактивирани мутантни щамове (Liao et al., 2017). Липсата на UBR5 е свързана с повишена апоптоза, некроза и инхибиране на туморния растеж при TNBC поради лоша ангиогенеза. Поради загубата на UBR5, разпространението на тумора към отдалечени органи е намалено и UBR5 индуцира анормален EMT главно чрез намаляване на експресията на E-cadherin (Zhang and Weinberg, 2018). Наскоро беше показано, че UBR5 е много важен фактор в индуцираната от IFN-γ транскрипция на PDL1 при TNBC поради липсата на убиквитинираща активност на E3. Анализът на РНК транскриптома разкри, че UBR5 може да има системни ефекти върху гени, свързани с IFN-γ пътя, и да насърчава трансактивацията на PDL1 чрез повишаване на нивата на активиране на протеин киназа РНК (PKR) и нейните сигнални преобразуватели и активатори, транскрипция 1 (STAT1) и интерферон регулаторен фактор 1 (IRF1). Въпреки това, CRISPR/Cas9-медиираната комбинирана аблация на експресията на UBR5 и PD-L1 има синергичен терапевтичен ефект, отколкото всяка от блокадите поотделно, с дълбоки ефекти върху туморната микросреда (Wu et al., 2022). Следователно, CRISPR/Cas9 може да бъде важен инструмент за инхибиране на функцията на UBR5, като по този начин потиска метастазите на TNBC и растежа на тумора.
ROR1 е трансмембранен протеин тип I, който се експресира по време на рак и ембрионално развитие и е идентифициран като онкофетален протеин (Nicholas Borcherding, 2014). Инвазивното поведение на различни видове рак при човека е свързано с повишена регулация на ROR1. Получени са обещаващи резултати от in vivo и in vitro проучвания, включващи терапевтични съединения, насочени към ROR1 (Chien et al., 2016). Повишените нива на ROR1 mRNA в биопсии на гръдната тъкан също са свързани с агресивни базалноподобни тумори на гърдата (BL) и тяхната миграция към други части на тялото. Освен това, свръхекспресията на ROR1 е идентифицирана като прогностичен маркер за развитието на TNBC (Chien et al., 2016). Въпреки това, заглушаването на ROR1 с помощта на CRISPR/Cas9 за потискане на растежа и метастазите на TNBC би било ефективна стратегия.
Процесът на сиалилиране включва добавяне на сиалова киселина към гликоконюгати, което се катализира от сиалилтрансферази (ST). ST8SIA1 принадлежи към семейството ST и играе важна роля в патогенезата на различни заболявания като лимфоцитна левкемия и колоректален рак (Chang et al., 2018). Анализът на РНК последователността показва, че ST8SIA1 е силно експресиран в гръдната тъкан на пациенти с TNBC и е положително корелиран с мутации в туморния супресорен ген p53, което може да допринесе за патогенезата на TNBC (Battula et al., 2017). Освен това, ST8SIA1 участва в метастазите и рецидивите на TNBC, което предполага, че играе важна роля в появата и развитието на TNBC. В in vitro модел на TNBC е показано, че нокдаунът на ST8SIA1 от CRIPSR/Cas9 блокира растежа и метастазите (Battula et al., 2017). Това предполага, че CRISPR/Cas9 може да бъде важен инструмент за инхибиране на функцията на онкогена ST8SIA1 при лечението на TNBC.
NAT1 е метаболитен ензим, който катализира образуването на ксенобиотични съединения от фаза II и се експресира в почти всички човешки тъкани. NAT1 може да използва кофактора фолат, за да се насочи към ацетил-CoA (ацетил-CoA) дори при липса на ароматен аминен субстрат (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Проучвания показват, че NAT1 регулира функцията на матриксна металопротеиназа 9 (MMP9) в модели на клетки на рак на гърдата и предпазва от реактивни кислородни видове (ROS) по време на глюкозно гладуване (Wang et al., 2018). Доказано е, че делецията на NAT1 инхибира пируват дехидрогеназния комплекс, което води до митохондриална дисфункция (Wang L. et al., 2019). Освен това, различни други доклади показват, че инхибирането на NAT1 с помощта на малки молекули и заглушаване на siRNA може да намали инвазивността и пролиферацията на клетките на рак на гърдата (Stepp et al., 2018). Наскоро CRISPR/Cas9 беше използван за потискане на NAT1 в клетъчната линия MDA-MB-231 на рак на гърдата, като повлиява клетъчния метаболизъм в зависимост от нивото на експресия. Това проучване също така показа, че NAT-1 е критичен за прогресията и метастазите на TNBC (Carlisle et al., 2020).
Координираната транскрипция на онкогените се регулира от суперенхансери, транскрипционни фактори и кофактори (Hnisz et al., 2015). Освен това, група циклин-зависими кинази (CDK), като CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 и CDK13, са необходими за транскрипционната регулация. Сред тях CDK7 участва във фосфорилирането на РНК полимераза II, което е много важно за инициирането и разширяването на онкогенната транскрипция в патогенезата на TNBC. В едно основополагащо проучване, делецията на CDK7 чрез CRISPR/Cas9 инхибира TNBC, което показва, че патогенезата на TNBC е CDK7-зависима (Wang Y. et al., 2015).
Проучвания показват, че мутациите в MYC и RBP (RNA binding protein) могат да доведат до апоптоза, докато единичните генни мутации в MYC или RBP не влияят на растежа на раковите клетки (Einstein et al., 2021). Повече от 1000 RBP в човешкия геном са били скринирани с помощта на библиотека, базирана на CRISPR/Cas9. Сред тях, 57 RBP са установени като критични за растежа на раковите клетки със силно повишени нива на MYC (Wheeler et al., 2020). В допълнение, YTHDF2 е важен за поддържане на растежа на TNBC клетките и намалява количеството метилирани транскрипти по време на транскрипция и транслация на високо ниво в ракови клетки с по-висока MYC експресия. Освен това, YTHDF2 не е от съществено значение за раковите клетки, които са по-малко зависими от повишените нива на MYC за удължаване на преживяемостта на пациенти с TNBC (Einstein et al., 2021), което предполага, че той може да бъде потенциална терапевтична цел за лекарства, които могат да преодолеят TNBC.
Цинковите пръстови протеини (ZNF) съставляват приблизително 1% от общия човешки геном. Проучвания показват, че ZNF може да регулира клетъчната пролиферация при различни видове рак, като рак на черния дроб, рак на гърдата и колоректален рак (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Библиотеки, генерирани чрез CRISPR нокаут, са използвани за скрининг на различни туморни супресорни гени (TSG) в ракови клетки на гърдата (Shalem et al., 2014). Оттогава транскриптомно проучване на CRISPR/Cas9 ZNF319-делирани ракови клетки на гърдата показва, че ZNF319 е туморен супресорен ген, който намалява пролиферацията на рака на гърдата и следователно участва в различни потенциални сигнални механизми и други биологични функции (Wang L. et al., 2022).
Фероптозата е вид програмирана клетъчна смърт, която зависи от наличието на желязо. Известно е, че развитието на фероптоза се влияе от наличието на липидни пероксиди. Освен това е съобщено, че PKCβII проявява ранна липидна пероксидация, а повишената липидна пероксидация е свързана с фероптоза. Скринингът на библиотека от CRISPR/Cas9-медиирани киназни инхибитори разкри, че PKCβII участва в процеса на липидна пероксидация, който е критичен за фероптозата в клетки MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Следователно, това предполага, че нокаутът на PKCβII от CRISPR/Cas9 може да бъде потенциална мишена на тумор-супресорния ген за лечение на заболявания, свързани с фероптоза (Zhang et al., 2022).
Смята се, че лекарствената резистентност е отговорна за приблизително 90% от смъртните случаи при пациенти с рак и е едно от основните предизвикателства в лечението на рака (Bukowski et al., 2020). Резултатите показват, че достатъчен брой гени, свързани с лекарствения ефлукс, репарацията на ДНК, апоптозата и различни клетъчни сигнални пътища, са свързани с лекарствена резистентност (Haider et al., 2020). Сред тях няколко гена са били таргетирани от CRISPR/Cas9 инструменти и са показали обещаващи резултати за намаляване на лекарствената резистентност и повишаване на ефективността на противораковите лечения (Vaghari-Tabari et al., 2022). Освен това, високопроизводителни CRISPR/Cas9 библиотеки за скрининг на нокаут гени са замесени в модифицирането на функцията на потенциални гени-мишени за лекарствена резистентност (Shalem et al., 2015). За идентифициране на гени за резистентност към паклитаксел е използвано РНК секвениране, съчетано със скрининг на sgRNA библиотека в целия геном, за да се идентифицират осем кандидат гена, включително хистон деацетилаза 9 (HDAC9), които са свързани с лекарствена резистентност при пациенти с рецидивиращ TNBC (B et al., 2020). В друго проучване е наблюдавана повишена експресия на дизерин/треонин и тирозин протеин киназа (DSTYK) по време на оцеляването на пациенти с TNBC, лекувани с противоракови лекарства. Освен това, CRISPR/Cas9-медиираното нокдаун на DSTYK значително е подобрило апоптозата на лекарствено-резистентни ракови клетки in vitro (SUM102PT клетки и MDA-MB-468 клетки) и in vivo TNBC модел (Ogbu et al., 2021).
Въпреки че TNBC има анормална активация на MAPK пътя, клиничният ефект от терапиите, насочени към MEK, е слаб. Скрининг на геномната библиотека CRISPR/Cas9 показа, че инхибирането на PSMG2 (шаперон 2 за сглобяване на протеома) сенсибилизира TNBC BT549 и MB468 клетки към MEK инхибитора AZD6244. CRISPR/Cas9 нокдаунът на PSMG2 промени нормалната протеазомна функция, което доведе до медиирано от автофагия разглобяване на PDPK1, като по този начин допълнително подобри туморните клетки в TNBC миши модели, индуцирани от AZD6244 (MEK инхибитор) и MG132 (протеазомен инхибитор). По този начин, протеазомните и MAP киназните (MEK) инхибитори могат да се прилагат синергично за намаляване на пролиферацията на туморните клетки (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 е използван и за скрининг за загуба на генна функция, водеща до резистентност към TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al. обясняват механизма на лекарствена резистентност на раковите клетки, третирани с JQ1, BET бромодоменен инхибитор (BBDI), при TNBC. Използвайки CRISPR/Cas9, те установяват, че заличаването на гена rb1 води до резистентност на TNBC към противораковото лекарство JQ1. Следователно, функцията на rb1 е важна в отговора на JQ1 лекарствата при TNBC. Те също така съобщават, че паклитаксел е инхибитор на CDK4/6 киназа/микротубули и комбинацията му с BBDI като JQ1 може да осигури обещаващи терапевтични отговори на лекарствено-резистентен TNBC (Ge et al., 2020).
Съобщава се, че транскрипционният пейзаж на дългата некодираща РНК (lncRNA) е отговорен за резистентността към неоадювантна терапия при TNBC. Това проучване показва, че пет различни MALAT1 lncRNA транскрипта са силно експресирани в TNBC. Освен това, CRISPR/Cas9-медиираната делеция на MALAT1 повишава чувствителността на TNBC BT-549 клетки към паклитаксел и доксорубицин, което предполага потенциална роля на MALAT1 резистентността при TNBC (Shaath et al., 2021).
Мутациите в BRCA1 (BRCA1m) са хетерогенни и следователно трудни за откриване. Насочването към PARP1 (поли(ADP-рибоза) полимераза), синтетичният летален партньор на BRCA1, може да увеличи химиочувствителността на TNBC към лекарства. Използвайки CRISPR/Cas9, делецията на PARP1 увеличи чувствителността на противоракови лекарства като доксорубицин, гемцитабин и доцетаксел към mBRCA1 мутантни TNBC клетки, което предполага, че PARP1 също участва в лекарствената резистентност при TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Известно е, че мутациите в туморните супресорни гени BRCA1 или BRCA2 увеличават вероятността от развитие на рак на гърдата при хора. Лечението на тези пациенти изисква използването на PARP инхибитори. Освен това е доказано, че нокаутът на нуклеотидния спасителен фактор DNPH1, използвайки CRISPR/Cas9, може да премахне токсичния нуклеотид 5-хидроксиметилдеоксиуридин (hmdU) монофосфат, като по този начин засили отговора на BRCA-дефицитни клетки към чувствителност към PARP инхибитори (Fugger). et al., 2021). Следователно, CRISPR/Cas9 и PARP1 инхибиторите могат да се превърнат във важна стратегия за лечение на TNBC.
Генът за пенетрантния гликопротеин (P-gp) е ген за мултилекарствена резистентност, който обикновено е повишен в приблизително 41% от всички случаи на не-тясно рак на гърдата (TNBC) (Sun et al., 2020). Индуцираният от P-gp ефлукс на лекарството е идентифициран като ключов регулатор на лекарствената резистентност при рак на гърдата. P-gp инхибиторите са показали повишена чувствителност към противоракови лекарства при рак на гърдата (Famta et al., 2021). Следователно, CRISPR/Cas9-медиираната аблация или потискане на P-gp и P-gp инхибиторите може да бъдат много важни методи за преодоляване на лекарствената резистентност при TNBC.
Известно е, че АТФ-свързващият касетен транспортер G2 (ABCG2) причинява лекарствена резистентност при TNBC (Palasuberniam et al., 2015), въпреки че понастоящем няма данни за връзката между CRISPR/Cas9 и заглушаването на ABCG2 и инактивирането на тумор-супресорните гени. PTEN може да усили активирането на ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Следователно, използването на CRISP/Ca9 за премахване на ABCG2 и комбинирането му с ABCG2 инхибитор може да бъде подходящо лечение за преодоляване на лекарствената резистентност при TNBC. Таблица 2 споменава CRISPR/Cas9, насочен към всички гени за резистентност.
Таблица 2. CRISPR/Cas9 е насочен към различни гени за резистентност към TNBC, за да сенсибилизира клетките към противоракови лекарства.
CRISPR/Cas9 библиотеките са потенциални инструменти за скрининг на генни мутации, свързани с патогенезата на рака (Chan et al., 2022). Този метод на скрининг включва четири стъпки, като (а) изграждане на библиотека, (б) лентивирусна трансдукция, (в) фенотипен скрининг и (г) анализ на целеви гени. Въпреки че TNBC има анормална активация на MAPK пътя, клиничната прогноза на MEK таргетна терапия за пациенти с TNBC, носещи мутации в туморни супресорни гени като PTEN, RB1 и TP53, е много лоша.
Освен това, скрининг за генно нокаутиране, използващ CRISPR/Cas9, тества най-мощната и селективна молекула, дехидрокатрол, която е в изобилие в екстракти от цветове и листа на Гватемала, за да се разбере ефектът на дехидрокатрола върху MDA-MB-231. Механизми на селективна клетъчна цитотоксичност. Характеристики на мезенхимната стволовост на TNBC подтипове. Този скрининг, базиран на CRISPR/Cas9, също така разкри, че HSD17B11, ген, кодиращ 17β-хидроксистероид дехидрогеназа тип 11, е силно експресиран в MDA-MB-231 клетки и води до дехидрофалкаринол, специфичен за MDA-MB-231 клетки (Grant et. al., 2020). Следователно, това предполага, че геномният скрининг с CRISPR/Cas9 има голям потенциал за идентифициране на механизмите, лежащи в основата на противораковите свойства на потенциални природни съединения.
Освен това, уязвимостта на TNBC към рак беше изследвана с помощта на безпристрастен in vivo CRISPR/Cas9 скрининг в целия геном, който показа връзка между онкогенните и тумор-супресорните пътища. Съобщава се, че ключови компоненти на mTOR и Hippo пътищата играят важна роля в туморната регулация при TNBC. Освен това, проучвания показват, че фармакологичното инхибиране на mTORC1/2 и YAP онкопротеина ефективно инхибира патогенността на TNBC, използвайки in vitro модел на лекарствено-матрична синергия и in vivo ксенотрансплантати, получени от пациент. Освен това, инхибирането на mTORC1/2, медиирано от Torin-1, засилва макропиноцитозата, докато индуцираното от вертепорфин инхибиране на YAP води до клетъчна смърт на TNBC. Взети заедно, тези резултати подчертават силата и стабилността на in vivo CRISPR скрининга в целия геном за идентифициране на нови и ефективни лечения за TNBC (Dai et al., 2021).
Дисрегулацията на имунната система е важен фактор в туморогенезата. Раковите клетки избягват имунното елиминиране, като заобикалят защитните механизми, включително намеса в активността на имунните клетки в туморната микросреда и компрометиране на имунната система. Следователно, разработването на подобрена имунна система може да бъде ключов подход за борба с туморите. Използването на генна модификация, базирана на CRISPR/Cas9, разглежда няколко проблема, свързани с имунната дисфункция, от различни гледни точки. CRISPR/Cas9 е използван за подобряване на противотуморния имунитет срещу рак на гърдата чрез следните пътища (Фигура 3).
Фигура 3. Имунотерапията с CRISPR/Cas9 е насочена към TNBC клетки. Загубата на CDK5 и потискането на PDL1 и CD155 засилват имунната система. По подобен начин, загубата на A2AR и потискането на TAA, като HER2, муцин 1 и TEM8, повишават ефективността на CAR-T клетките при убиване на ракови клетки. CRISPR/Cas9-индуцираният Т-клетъчен скрининг показва, че нарушаването на p38 киназата засилва противотуморната активност на Т клетките. Т клетките, модифицирани от CRISPR/Cas9, увеличават експресията на TCR (Т-клетъчен рецептор), което води до противотуморна активност на Т клетките.
Целта на имунотерапията е да стимулира имунната система да атакува раковите клетки. Свръхекспресията на имунни контролни протеини обикновено предотвратява автоимунни реакции, но може да помогне на раковите заболявания да ги избегнат (Topalian et al., 2015). Тези протеини предотвратяват имунните реакции чрез свързване с рецептори на повърхността на имунните клетки. Множество контролни протеини (като CD155 и PD-L1) са насочени към PD-1 рецептора върху имунните клетки и се експресират при рак на гърдата, особено TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Нокдаунът на PD-L1 или неговия рецептор с помощта на CRISPR/Cas9 може да стимулира имунната система да атакува TNBC тумори (Yahata et al., 2019). Освен това, е доказано, че понижаването на експресията на PD-L1 чрез CRISPR/Cas9-медиирана делеция на CDK5 инхибира растежа на тумора in vitro и in vivo (Deng et al., 2020). Инхибирането на растежа в in vitro и in vivo модели на рак на гърдата предполага, че shRNA-медиираното намаляване на CD155 може да има терапевтичен ефект върху рака на гърдата (Gao et al., 2018).
CAR Т клетките експресират CAR, които разпознават тумор-асоциирани антигени (TAA) и могат да използват нокдаун на контролни протеини, за да усилят своята активност (Li C. et al., 2020). Съществуват различни потенциални мишени за CAR Т клетъчна терапия при рак на гърдата, включително няколко TAA като HER2, mucin1 и TEM8 (Bajgain et al., 2018). Има доказателства, че CAR Т клетките, насочени към мезотелин (свръхекспресиран в TNBC BT-459 клетки), са по-ефективни срещу рак, когато PD-1 е нокаутиран с помощта на CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Изолирането на Т клетки от пациенти и последващото им редактиране ex vivo обаче е трудоемък и времеемък процес. Въпреки че универсалните Т клетки могат да намалят изискванията за изолация, донорските Т клетки, експресиращи човешки левкоцитен антиген (HLA) клас I и Т клетъчен рецептор (TCR), трябва да бъдат отстранени, за да се предотвратят аномалии на реакцията присадка срещу гостоприемник (Ren et al., 2017, 2017a). Използвайки CRISPR/Cas9, HDR може едновременно да елиминира TCR и HLA и да нокаутира гена, кодиращ CAR. Проучвания показват, че CRISPR/Cas9 може да се използва за въвеждане на анти-CD19 CAR в TCR локуса, като по този начин ефективно се произвеждат CAR без изчерпване на Т-клетките (Dimitri et al., 2022). Разработени са мултиплексни технологии за генериране на алогенни CAR Т-клетки чрез едновременно елиминиране на TCR, бета-2-микроглобулин (B2M), HLA-I субединица и други протеини като PD-1 и CTLA-4, които могат да имат по-големи противоракови свойства срещу TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Използването на CRISPR/Cas9 може да подобри ефективността на CAR-T клетките. Известно е, че аденозинът има имуносупресивни свойства и може да намали противораковия имунитет чрез блокиране на функцията на Т-клетките и активиране на аденозиновите A2A рецептори (A2AR) (Vigano et al., 2019). Заглушаването на A2AR с помощта на CRISPR/Cas9 значително подобри ефикасността на CAR-T клетките in vivo (Giuffrida et al., 2021). Известно е, че Т-клетките проявяват различни фенотипни характеристики, като клетъчно разширяване, диференциация, оксидативен стрес и геномен стрес. CRISPR/Cas9-базираният Т-клетъчен скрининг разкри нарушаване на 25 различни Т-клетъчни рецепторни кинази. Сред тях е доказано, че делецията на p38 киназата усилва противотуморната активност на Т-клетките, което показва, че p38 киназата е ключов регулатор на CAR-T клетъчната регулация (Gurusamy et al., 2020).
Т-клетките могат да бъдат генетично модифицирани с помощта на CRISPR/Cas9, за да произведат силно експресирани TCR. Трансферът на генетично модифицирани Т-клетки към пациенти е показал по-силна противоракова активност в сравнение с ендогенните Т-клетки. Следователно, ендогенните TCR могат да се конкурират с генетично модифицирани TCR при пациенти, което може да повлияе на потенциала на имунотерапията при рак. За да се преодолее този проблем, използването на CRISPR/Cas9 за отстраняване на ендогенен TCR-β в реципиентните клетки и последващо трансфериране на TCR-β Т-клетки към пациенти с рак може да покаже по-добри противоракови имунни отговори, без да е необходима ендогенна сексуална конкуренция между TCR (Fan et al. 2018). По този начин, с изключение на CRISPR-модифицираните Т-клетки, TCR са хиляда пъти по-чувствителни към туморни антигени, отколкото нормалните TCR-трансдуцирани Т-клетки. Освен това, при различни левкемии, променените Т-клетки, генерирани от γδ TCR+ CRISPR, показват по-висока експресия на CD4+ и CD8+ Т-клетки, отколкото стандартния TCR трансфер (Legut et al., 2018). Следователно, модифицираните Т-клетки, генерирани чрез CRISPR/Cas9, могат да бъдат ефективен метод за имунотерапия за преодоляване на TNBC.
Интегрините са молекули на клетъчната адхезия, които присъстват в клетъчните трансмембрани и насърчават свързването на клетките с извънклетъчната матрица (ECM) (Hamidi and Ivaska, 2018). Дисрегулацията на интегрините е свързана с развитието и миграцията на рак чрез промяна на извънклетъчната матрица, което води до оцеляване на раковите клетки в кръвообращението (Hamidi and Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-медиираното потискане на интегрина забавя прогресията на тумора, метастазите и колонизацията при TNBC. Съобщава се, че потискането на интегрин a5 (ITGA5) намалява клетъчната миграция и прогресия при други видове рак, като рак на белия дроб (Ju et al., 2017), което предполага, че интегрин a5 може също да бъде ключов фактор в патогенезата на TNBC.
Генерирането на нокаут мишки с помощта на традиционни методи с ембрионални стволови (ES) клетки е трудоемък, отнемащ време и неефективен процес. Отнема месеци и години, за да се насочат ES клетките чрез хомоложна рекомбинация, да се размножат химерни мишки и след това да се кръстосват с хетерозиготни мишки, за да се получи хомозиготно потомство. Необходимо е сложно кръстосване, за да се създадат мишки с множество генетични мутации. Въпреки това, възникнаха много проблеми при използването на мишки, генерирани чрез аблация на ES клетки с помощта на CRISPR/Cas9 или чрез микроинжектиране на CRISPR/Cas9 компоненти в оплодени яйцеклетки от единични клетки. Например, въвеждането на промени често се случва в биалелни локуси и не е генно специфично. Наскоро беше съобщено, че ES клетки, използващи CRISPR/Cas9 технология, могат едновременно да вмъкват биалелни мутации в до 5 гена (Nishizono et al., 2021). За тази цел, Cas9 mRNA и пет генно-специфични gRNA бяха едновременно трансфектирани в ES клетки. Това подчертава обещанието и ефективността на тази процедура, въпреки че тези мутации може да са били предадени, когато са били селектирани основателски линии, за да се получат петкратно нокаутирани мишки. Проучването също така съобщава за изненадващо откритие: ES клетките вече не са необходими за създаване на генетично модифицирани мишки. Вместо това, за да се премахнат специфични генни продукти, Cas9 mRNA и gRNA са инжектирани в ембриони на едноклетъчен стадий. В резултат на това са създадени нокаут основателски линии, които теоретично могат да се използват за изучаване на последиците от генна делеция при мишки (Qin et al., 2016). По този начин, CRISPR/Cas9 позволява създаването на трансгенни мишки за лечение на TNBC на по-ниска цена от традиционното генно инженерство. Използвайки системата CRISPR/Cas, е разработен нов модел на нокаут мишка, който може успешно да въведе точкови мутации в един или повече ендогенни гени в TNBC. Въз основа на тази концепция, животински модели на TNBC също могат да бъдат разработени, използвайки CRISPR/Cas9-медиирана делеция на BRCA1 и p53, което води до загуба на HR ремонт, геномна нестабилност и мутантни фенотипове (Annunziato et al., 2020).
В момента за диагностициране на TNBC се използват различни методи като мамография, магнитно-резонансна томография (MRI) и ултразвук. Тези методи обаче имат някои ограничения. Мамографията се използва за диагностициране на локална тъкан на гърдата, а не на метастази, където раковите клетки са мигрирали към други органи. Ултрасонографията не е надежден метод за диагностициране на TNBC (Chen and Lee-Felker, 2023). ЯМР има по-висока чувствителност от ултразвука и мамографията, но диагностичната му точност е ограничена (Sha and Chen, 2022). Тъканната биопсия е инвазивен начин за идентифициране на ракови клетки. В някои случаи обаче биопсията може да пропусне раковата тъкан, ако иглата се отклони от областта на интерес. Освен това е много скъпа и може да бъде травмираща за пациента. TNBC е хетерогенен вид рак, така че биопсията може да не предостави достатъчно информация за вида на рака. Следователно, спешно е необходим нов диагностично надежден метод за откриване на TNBC. CRISPR/Cas9 може да служи като високочувствителна и минимално инвазивна алтернатива за диагностициране на рак на гърдата. За тази цел, стратегиите, базирани на CRISPR/Cas9, могат да се използват за подобряване на PCR методите за диагностициране на TNBC. Първо, протеините Cas9 и cpf1 на CRISPR системата се използват за отстраняване на неспецифична ДНК, след което тези два протеина (Cas9 и cpf1) могат да разпознаят PAM последователността, преди да се свържат с целевата ДНК (Deepak Singh et al., 2021). По този начин, PCR може да идентифицира мутации, свързани с развитието на рак. Няколко проучвания са възприели тази стратегия, базирана на CRISPR, за откриване на различни мутации в различни видове рак (Safari et al., 2019). По този начин, PCR методите, базирани на CRISPR, могат да намалят зависимостта на диагностиката на TNBC от инвазивни методи, като имунохистохимия, базирана на биопсия.
Генотипни промени в регулацията на хормоналните рецептори са демонстрирани и при TNBC (Chen and Russo, 2009). PCR стратегиите, базирани на CRISPR/Cas9, използващи микрочипове за диагностика на място, могат ефективно да наблюдават тези мутации (Hajian et al., 2019). Те биха могли също така да предоставят на здравните специалисти подходяща информация за специфични мутации при пациенти с TNBC, което би могло да помогне за подобряване на курса на лечение. Тази комбинирана техника обаче има ограничения. Следователно са необходими обширни изследователски усилия, преди този CRISPR/Cas-PCR метод да може да се използва в здравеопазването за диагностициране на TNBC (Yang et al., 2019).
Време на публикуване: 14 октомври 2024 г.