Диференциалната диагноза на белодробни нодули, идентифицирани чрез компютърна томография (КТ), остава предизвикателство в клиничната практика. Тук ние характеризираме глобалния метаболом на 480 серумни проби, включително здрави контроли, доброкачествени белодробни нодули и белодробен аденокарцином в стадий I. Аденокарциномите показват уникални метаболомни профили, докато доброкачествените нодули и здравите индивиди имат голямо сходство в метаболомните профили. В групата на откриването (n = 306) беше идентифициран набор от 27 метаболита, за да се разграничат доброкачествените от злокачествените нодули. AUC на дискриминантния модел в групите с вътрешна валидация (n = 104) и външна валидация (n = 111) беше съответно 0,915 и 0,945. Анализът на пътеката разкри повишени гликолитични метаболити, свързани с намален триптофан в серума на белодробния аденокарцином в сравнение с доброкачествените нодули и здравите контроли, и предполага, че усвояването на триптофан насърчава гликолизата в раковите клетки на белия дроб. Нашето проучване подчертава стойността на биомаркерите на серумните метаболити при оценката на риска от белодробни нодули, открити чрез КТ.
Ранната диагностика е от решаващо значение за подобряване на процента на преживяемост при пациенти с рак. Резултатите от Националното проучване за скрининг на рак на белия дроб в САЩ (NLST) и Европейското проучване NELSON показват, че скринингът с нискодозова компютърна томография (LDCT) може значително да намали смъртността от рак на белия дроб във високорисковите групи1,2,3. След широкото използване на LDCT за скрининг на рак на белия дроб, честотата на случайни рентгенографски находки на асимптоматични белодробни нодули продължава да се увеличава4. Белодробните нодули се определят като фокални помътнявания с диаметър до 3 см5. Сблъскваме се с трудности при оценката на вероятността от злокачествено заболяване и при справянето с големия брой белодробни нодули, открити случайно при LDCT. Ограниченията на КТ могат да доведат до чести последващи прегледи и фалшиво положителни резултати, което води до ненужна интервенция и прекомерно лечение6. Следователно е необходимо да се разработят надеждни и полезни биомаркери за правилно идентифициране на рак на белия дроб в ранните стадии и диференциране на повечето доброкачествени нодули при първоначално откриване7.
Цялостният молекулярен анализ на кръвта (серум, плазма, периферни кръвни мононуклеарни клетки), включително геномика, протеомика или ДНК метилиране8,9,10, доведе до нарастващ интерес към откриването на диагностични биомаркери за рак на белия дроб. Междувременно, метаболомичните подходи измерват клетъчните крайни продукти, които са повлияни от ендогенни и екзогенни действия и следователно се прилагат за прогнозиране на началото и изхода на заболяването. Течната хроматография-тандемна масспектрометрия (LC-MS) е широко използван метод за метаболомични изследвания поради високата си чувствителност и широк динамичен диапазон, който може да обхване метаболити с различни физикохимични свойства11,12,13. Въпреки че глобалният метаболомен анализ на плазмата/серума е използван за идентифициране на биомаркери, свързани с диагнозата рак на белия дроб14,15,16,17 и ефикасността на лечението,18 класификаторите на серумните метаболити за разграничаване между доброкачествени и злокачествени белодробни възли все още не са добре проучени. - масивни изследвания.
Аденокарциномът и плоскоклетъчният карцином са двата основни подтипа на недребноклетъчен рак на белия дроб (NSCLC). Различни компютърно-томографски (КТ) скринингови тестове показват, че аденокарциномът е най-често срещаният хистологичен тип рак на белия дроб1,19,20,21. В това проучване използвахме ултра-ефективна течна хроматография с висока резолюция (UPLC-HRMS), за да извършим метаболомен анализ на общо 695 серумни проби, включително здрави контроли, доброкачествени белодробни нодули и КТ-открити ≤3 cm. Скрининг за белодробен аденокарцином в стадий I. Идентифицирахме панел от серумни метаболити, които разграничават белодробния аденокарцином от доброкачествените нодули и здрави контроли. Анализът за обогатяване на пътеката разкри, че анормалният метаболизъм на триптофан и глюкоза са чести промени в белодробния аденокарцином в сравнение с доброкачествените нодули и здрави контроли. Накрая, създадохме и валидирахме серумен метаболитен класификатор с висока специфичност и чувствителност за разграничаване между злокачествени и доброкачествени белодробни нодули, открити чрез LDCT, което може да помогне за ранна диференциална диагноза и оценка на риска.
В настоящото проучване, серумни проби, съответстващи по пол и възраст, са събрани ретроспективно от 174 здрави контроли, 292 пациенти с доброкачествени белодробни възли и 229 пациенти с белодробен аденокарцином в стадий I. Демографските характеристики на 695-те участници са показани в Допълнителна таблица 1.
Както е показано на Фигура 1а, общо 480 серумни проби, включително 174 проби от здрава контрола (HC), 170 доброкачествени възли (BN) и 136 проби от белодробен аденокарцином (LA) в стадий I, са събрани в Онкологичния център на Университета Сун Ятсен. Кохорта за откриване на нецеленасочено метаболомно профилиране, използваща ултраефективна течна хроматография с висока резолюция (UPLC-HRMS). Както е показано на Допълнителна Фигура 1, диференциалните метаболити между LA и HC, LA и BN са идентифицирани, за да се установи класификационен модел и да се проучи по-нататъшно анализът на диференциалните пътища. 104 проби, събрани от Онкологичния център на Университета Сун Ятсен, и 111 проби, събрани от две други болници, са подложени съответно на вътрешна и външна валидация.
a Изследвана популация в кохортата на откритието, която е претърпяла глобален серумен метаболомен анализ, използвайки ултрапроизводителна течна хроматография с висока резолюция (UPLC-HRMS). b Дискриминантен анализ с частични най-малки квадрати (PLS-DA) на общия метаболом на 480 серумни проби от изследваната кохорта, включително здрави контроли (HC, n = 174), доброкачествени нодули (BN, n = 170) и белодробен аденокарцином в стадий I (Лос Анджелис, n = 136). +ESI, режим на положителна електроспрей йонизация, -ESI, режим на отрицателна електроспрей йонизация. c–e Метаболити със значително различно съдържание в две дадени групи (двустранен тест за ранг на знаците на Уилкоксън, коригирана p-стойност за процента на фалшиво откриване, FDR <0,05) са показани в червено (кратна промяна > 1,2) и синьо (кратна промяна < 0,83). ), показани на графиката на вулкана. f Йерархична топлинна карта на клъстериране, показваща значителни разлики в броя на анотираните метаболити между LA и BN. Изходните данни се предоставят под формата на файлове с изходни данни.
Общият серумен метаболом на 174 HC, 170 BN и 136 LA в групата на откритието беше анализиран с помощта на UPLC-HRMS анализ. Първо показваме, че пробите за качествен контрол (QC) се групират плътно в центъра на модел на неконтролиран анализ на главните компоненти (PCA), потвърждавайки стабилността на резултатите от настоящото проучване (Допълнителна фигура 2).
Както е показано в анализа с частични най-малки квадрати-дискриминант (PLS-DA) на Фигура 1b, установихме, че има ясни разлики между LA и BN, LA и HC в положителни (+ESI) и отрицателни (−ESI) режими на електроспрей йонизация. Не бяха открити обаче съществени разлики между BN и HC в условия +ESI и -ESI.
Открихме 382 диференциални характеристики между LA и HC, 231 диференциални характеристики между LA и BN и 95 диференциални характеристики между BN и HC (тест за ранг на знаци на Wilcoxon, FDR <0.05 и множествена промяна >1.2 или <0.83) (Фигура .1c-e). Пиковете бяха допълнително анотирани (Допълнителни данни 3) спрямо база данни (библиотека mzCloud/HMDB/Chemspider) чрез m/z стойност, време на задържане и търсене на масспектър на фрагментация (подробности описани в раздела Методи)22. Накрая, 33 и 38 анотирани метаболита със значителни разлики в изобилието бяха идентифицирани съответно за LA спрямо BN (Фигура 1f и Допълнителна таблица 2) и LA спрямо HC (Допълнителна фигура 3 и Допълнителна таблица 2). За разлика от това, само 3 метаболита със значителни разлики в изобилието бяха идентифицирани в BN и HC (Допълнителна таблица 2), което е в съответствие с припокриването между BN и HC в PLS-DA. Тези диференциални метаболити обхващат широк спектър от биохимични вещества (Допълнителна фигура 4). Взети заедно, тези резултати показват значителни промени в серумния метаболом, които отразяват злокачествена трансформация на рак на белия дроб в ранен стадий в сравнение с доброкачествени белодробни нодули или здрави индивиди. В същото време, сходството на серумния метаболом на BN и HC предполага, че доброкачествените белодробни нодули могат да споделят много биологични характеристики със здрави индивиди. Като се има предвид, че мутациите в гена на рецептора на епидермалния растежен фактор (EGFR) са често срещани при белодробен аденокарцином подтип 23, ние се стремихме да определим влиянието на драйверните мутации върху серумния метаболом. След това анализирахме общия метаболомен профил на 72 случая с EGFR статус в групата с белодробен аденокарцином. Интересното е, че открихме сравними профили между пациенти с EGFR мутация (n = 41) и пациенти с EGFR див тип (n = 31) при PCA анализ (Допълнителна фигура 5a). Въпреки това, идентифицирахме 7 метаболита, чието изобилие беше значително променено при пациенти с EGFR мутация в сравнение с пациенти с див тип EGFR (t-тест, p < 0,05 и промяна в пъти > 1,2 или < 0,83) (Допълнителна фигура 5b). По-голямата част от тези метаболити (5 от 7) са ацилкарнитини, които играят важна роля в пътищата на окисление на мастни киселини.
Както е илюстрирано в работния процес, показан на Фигура 2а, биомаркерите за класификация на нодулите са получени с помощта на оператори за най-малко абсолютно свиване и селекция въз основа на 33 диференциални метаболита, идентифицирани в LA (n = 136) и BN (n = 170). Най-добра комбинация от променливи (LASSO) – модел на двоичен логистичен регресионен модел. За тестване на надеждността на модела е използвана десеткратна кръстосана валидация. Изборът на променливи и регуляризацията на параметрите са коригирани чрез наказание за максимизиране на вероятността с параметър λ24. Глобалният метаболомен анализ е извършен допълнително независимо в групите за вътрешна валидация (n = 104) и външна валидация (n = 111), за да се тества класификационната ефективност на дискриминантния модел. В резултат на това 27 метаболита в набора за откриване са идентифицирани като най-добрият дискриминантен модел с най-голяма средна стойност на AUC (Фиг. 2b), сред които 9 имат повишена активност, а 18 - намалена активност в LA в сравнение с BN (Фиг. 2в).
Работен процес за изграждане на класификатор на белодробни нодули, включително избиране на най-добрия панел от серумни метаболити в набора за откриване, използвайки двоичен логистичен регресионен модел чрез десеткратна кръстосана валидация и оценка на предсказуемата ефективност във вътрешни и външни набори за валидиране. b Статистика за кръстосана валидация на LASSO регресионен модел за селекция на метаболитен биомаркер. Числата, дадени по-горе, представляват средния брой биомаркери, избрани при дадено λ. Червената пунктирана линия представлява средната стойност на AUC при съответната ламбда. Сивите ленти за грешки представляват минималните и максималните стойности на AUC. Пунктираната линия показва най-добрия модел с 27 избрани биомаркера. AUC, площ под кривата на ROC (Receiver Operating Character). c Промени в пъти на 27 избрани метаболита в LA групата в сравнение с BN групата в групата за откриване. Червена колона – активиране. Синята колона е спад. d–f Криви на ROC (Receiver Operating Character), показващи мощността на дискриминантния модел, базиран на 27 комбинации от метаболити в наборите за откриване, вътрешна и външна валидация. Изходните данни са предоставени под формата на файлове с изходни данни.
Създаден е модел за прогнозиране, базиран на претеглените регресионни коефициенти на тези 27 метаболита (Допълнителна таблица 3). ROC анализът, базиран на тези 27 метаболита, дава стойност на площта под кривата (AUC) от 0,933, чувствителността на групата за откриване е 0,868, а специфичността е 0,859 (Фиг. 2d). Междувременно, сред 38-те анотирани диференциални метаболита между LA и HC, набор от 16 метаболита постига AUC от 0,902 с чувствителност 0,801 и специфичност 0,856 при разграничаване на LA от HC (Допълнителна фигура 6a-c). Сравнени са и стойностите на AUC, базирани на различни прагове на промяна в пъти за диференциалните метаболити. Установихме, че класификационният модел се представя най-добре при разграничаване между LA и BN (HC), когато нивото на промяна в пъти е зададено на 1,2 спрямо 1,5 или 2,0 (Допълнителна фигура 7a,b). Класификационният модел, базиран на 27 метаболитни групи, е допълнително валидиран във вътрешни и външни кохорти. AUC беше 0,915 (чувствителност 0,867, специфичност 0,811) за вътрешна валидация и 0,945 (чувствителност 0,810, специфичност 0,979) за външна валидация (фиг. 2e, f). За да се оцени междулабораторната ефективност, 40 проби от външната кохорта бяха анализирани във външна лаборатория, както е описано в раздела „Методи“. Точността на класификацията достигна AUC от 0,925 (допълнителна фигура 8). Тъй като плоскоклетъчният карцином на белия дроб (LUSC) е вторият най-често срещан подтип на недребноклетъчен рак на белия дроб (NSCLC) след белодробния аденокарцином (LUAD), ние също така тествахме валидираната потенциална полезност на метаболитните профили. BN и 16 случая на LUSC. AUC за дискриминация между LUSC и BN беше 0,776 (допълнителна фигура 9), което показва по-лоша способност в сравнение с дискриминацията между LUAD и BN.
Проучвания показват, че размерът на нодулите на КТ изображенията е положително корелиран с вероятността от злокачествено заболяване и остава основен фактор за лечение на нодулите25,26,27. Анализът на данните от голямата кохорта на скрининговото проучване NELSON показа, че рискът от злокачествено заболяване при пациенти с лимфни възли <5 mm е дори подобен на този при пациенти без лимфни възли28. Следователно, минималният размер, изискващ редовно КТ наблюдение, е 5 mm, както е препоръчано от Британското торакално дружество (BTS), и 6 mm, както е препоръчано от Дружеството на Флайшнер29. Въпреки това, нодулите, по-големи от 6 mm и без очевидни доброкачествени характеристики, наречени неопределени белодробни нодули (IPN), остават основно предизвикателство при оценката и лечението в клиничната практика30,31. След това изследвахме дали размерът на нодулите влияе върху метаболомните сигнатури, използвайки обединени проби от кохортите за откриване и вътрешно валидиране. Фокусирайки се върху 27 валидирани биомаркера, първо сравнихме PCA профилите на HC и BN под 6 mm метаболоми. Установихме, че повечето от данните за HC и BN се припокриват, което показва, че нивата на серумните метаболити са сходни и в двете групи (фиг. 3a). Картите на характеристиките в различните диапазони на размерите остават запазени в BN и LA (фиг. 3b, c), докато се наблюдава разделяне между злокачествени и доброкачествени нодули в диапазона 6–20 mm (фиг. 3d). Тази кохорта има AUC от 0,927, специфичност от 0,868 и чувствителност от 0,820 за прогнозиране на злокачествеността на нодули с размери от 6 до 20 mm (фиг. 3e, f). Нашите резултати показват, че класификаторът може да улови метаболитни промени, причинени от ранна злокачествена трансформация, независимо от размера на нодула.
ad Сравнение на PCA профилите между определени групи въз основа на метаболитен класификатор от 27 метаболита. CC и BN < 6 mm. b BN < 6 mm спрямо BN 6–20 mm. в LA 6–20 mm спрямо LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm и LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Крива на ROC (Receiver Operating Character), показваща производителността на дискриминантния модел за нодули 6–20 mm. f Стойностите на вероятността са изчислени въз основа на логистичния регресионен модел за нодули с размери 6–20 mm. Сивата пунктирана линия представлява оптималната гранична стойност (0,455). Числата по-горе представляват процента на прогнозираните случаи за Лос Анджелис. Използвайте двустранен t-тест на Стюдънт. PCA, анализ на главните компоненти. AUC площ под кривата. Изходните данни са предоставени под формата на файлове с изходни данни.
Четири проби (на възраст 44–61 години) с подобни размери на белодробните нодули (7–9 mm) бяха допълнително избрани, за да илюстрират ефективността на предложения модел за прогнозиране на злокачествени заболявания (фиг. 4a, b). При първоначален скрининг, Случай 1 се представи като солиден нодул с калцификация, характеристика, свързана с доброкачественост, докато Случай 2 се представи като неопределен частично солиден нодул без очевидни доброкачествени характеристики. Три кръга последващи компютърни томографии показаха, че тези случаи остават стабилни за период от 4 години и следователно се считат за доброкачествени нодули (фиг. 4a). В сравнение с клиничната оценка на серийни компютърни томографии, еднократният анализ на серумните метаболити с текущия класификаторен модел бързо и правилно идентифицира тези доброкачествени нодули въз основа на вероятностни ограничения (Таблица 1). Фигура 4b в случай 3 показва нодул с признаци на плеврална ретракция, която най-често се свързва със злокачествено заболяване32. Случай 4 се представи като неопределен частично солиден нодул без данни за доброкачествена причина. Всички тези случаи бяха предсказани като злокачествени според класификаторния модел (Таблица 1). Оценката на белодробния аденокарцином беше демонстрирана чрез хистопатологично изследване след белодробна резекция (фиг. 4б). За външния валидационен набор, метаболитният класификатор точно предсказа два случая на неопределени белодробни нодули, по-големи от 6 mm (допълнителна фигура 10).
КТ изображения на аксиалния прозорец на белите дробове при два случая на доброкачествени нодули. В случай 1, КТ сканирането след 4 години показва стабилен солиден нодул с размери 7 mm с калцификация в долния десен лоб. В случай 2, КТ сканирането след 5 години разкрива стабилен, частично солиден нодул с диаметър 7 mm в горния десен лоб. b КТ изображения на белите дробове в аксиален прозорец и съответните патологични изследвания на два случая на аденокарцином в стадий I преди белодробна резекция. Случай 3 разкрива нодул с диаметър 8 mm в горния десен лоб с плеврална ретракция. Случай 4 разкрива частично солиден нодул тип „матово стъкло“ с размери 9 mm в горния ляв лоб. Оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) на резецирана белодробна тъкан (скала = 50 μm), демонстриращо ацинарен модел на растеж на белодробния аденокарцином. Стрелките показват нодули, открити на КТ изображенията. H&E изображенията са представителни изображения на множество (>3) микроскопски полета, изследвани от патолога.
Взети заедно, нашите резултати показват потенциалната стойност на биомаркерите на серумните метаболити в диференциалната диагноза на белодробните нодули, което може да представлява предизвикателство при оценката на КТ скрининга.
Въз основа на валидиран диференциален метаболитен панел, ние се стремихме да идентифицираме биологични корелати на основните метаболитни промени. Анализът за обогатяване на KEGG пътища от MetaboAnalyst идентифицира 6 често срещани значително променени пътя между двете дадени групи (LA срещу HC и LA срещу BN, коригирано p ≤ 0,001, ефект > 0,01). Тези промени се характеризираха с нарушения в метаболизма на пирувата, метаболизма на триптофана, метаболизма на ниацина и никотинамида, гликолизата, TCA цикъла и метаболизма на пурина (фиг. 5а). След това извършихме допълнително таргетна метаболомика, за да проверим основните промени, използвайки абсолютно количествено определяне. Определяне на често срещани метаболити в често променените пътища чрез тройна квадруполна масспектрометрия (QQQ), използвайки автентични метаболити стандарти. Демографските характеристики на целевата извадка от метаболомичното изследване са включени в Допълнителна таблица 4. В съответствие с нашите глобални метаболомични резултати, количественият анализ потвърди, че хипоксантинът и ксантинът, пируватът и лактатът са повишени в LA в сравнение с BN и HC (фиг. 5b, c, p <0,05). Въпреки това, не са открити значителни разлики в тези метаболити между BN и HC.
Анализ на обогатяване на KEGG пътя на значително различни метаболити в LA групата в сравнение с BN и HC групите. Използван е двустранен Globaltest и p стойностите са коригирани с помощта на метода на Holm-Bonferroni (коригирано p ≤ 0,001 и размер на ефекта > 0,01). b–d Диаграми на цигулка, показващи нивата на хипоксантин, ксантин, лактат, пируват и триптофан в серумните HC, BN и LA, определени чрез LC-MS/MS (n = 70 на група). Белите и черните пунктирани линии показват съответно медианата и квартила. e Диаграми на цигулка, показващи нормализирана Log2TPM (транскрипти на милион) mRNA експресия на SLC7A5 и QPRT в белодробен аденокарцином (n = 513) в сравнение с нормална белодробна тъкан (n = 59) в набора от данни LUAD-TCGA. Бялата кутия представлява интерквартилния диапазон, хоризонталната черна линия в центъра представлява медианата, а вертикалната черна линия, простираща се от кутията, представлява 95% доверителен интервал (ДИ). f Диаграма на корелацията на Пиърсън на експресията на SLC7A5 и GAPDH в белодробен аденокарцином (n = 513) и нормална белодробна тъкан (n = 59) в набора от данни TCGA. Сивата зона представлява 95% ДИ. r, коефициент на корелация на Пиърсън. g Нормализирани клетъчни нива на триптофан в клетки A549, трансфектирани с неспецифичен shRNA контрол (NC) и shSLC7A5 (Sh1, Sh2), определени чрез LC-MS/MS. Представен е статистически анализ на пет биологично независими проби във всяка група. h Клетъчни нива на NADt (общ NAD, включително NAD+ и NADH) в клетки A549 (NC) и клетки A549 с нокдаун SLC7A5 (Sh1, Sh2). Представен е статистически анализ на три биологично независими проби във всяка група. i Гликолитичната активност на клетки A549 преди и след потискането на SLC7A5 беше измерена чрез скорост на извънклетъчно подкиселяване (ECAR) (n = 4 биологично независими проби на група). 2-DG,2-деокси-D-глюкоза. В (b–h) беше използван двустранен t-тест на Стюдънт. В (g–i) границите на грешките представляват средната стойност ± SD, всеки експеримент е проведен три пъти независимо и резултатите са сходни. Изходните данни са предоставени под формата на файлове с изходни данни.
Като се има предвид значителното въздействие на променения метаболизъм на триптофан в групата с LA, ние също така оценихме серумните нива на триптофан в групите с HC, BN и LA, използвайки QQQ. Установихме, че серумният триптофан е намален в LA в сравнение с HC или BN (p < 0,001, Фигура 5d), което е в съответствие с предишни открития, че нивата на циркулиращия триптофан са по-ниски при пациенти с рак на белия дроб, отколкото при здрави контроли от контролната група33,34,35. Друго проучване, използващо PET/CT трасер 11C-метил-L-триптофан, установи, че времето за задържане на триптофановия сигнал в тъканта на рака на белия дроб е значително увеличено в сравнение с доброкачествените лезии или нормалната тъкан36. Предполагаме, че намаляването на триптофана в серума на LA може да отразява активното усвояване на триптофан от клетките на рака на белия дроб.
Известно е също, че крайният продукт на кинурениновия път на катаболизма на триптофана е NAD+37,38, който е важен субстрат за реакцията на глицералдехид-3-фосфат с 1,3-бисфосфоглицерат в гликолизата39. Докато предишни изследвания са се фокусирали върху ролята на катаболизма на триптофана в имунната регулация, ние се стремим да изясним взаимодействието между дисрегулацията на триптофана и гликолитичните пътища, наблюдавани в настоящото изследване. Известно е, че член 5 от семейството на транспортерите на разтворени вещества 7 (SLC7A5) е транспортер на триптофан43,44,45. Хинолиновата киселина фосфорибозилтрансфераза (QPRT) е ензим, разположен надолу по веригата от кинурениновия път, който превръща хинолиновата киселина в NAMN46. Проверката на набора от данни на LUAD TCGA показа, че както SLC7A5, така и QPRT са значително повишени в туморната тъкан в сравнение с нормалната тъкан (фиг. 5д). Това увеличение се наблюдава в стадии I и II, както и в стадии III и IV на белодробния аденокарцином (Допълнителна фигура 11), което показва ранни нарушения в метаболизма на триптофана, свързани с туморогенезата.
Освен това, наборът от данни LUAD-TCGA показа положителна корелация между експресията на SLC7A5 и GAPDH mRNA в проби от пациенти с рак (r = 0,45, p = 1,55E-26, Фигура 5f). За разлика от това, не беше открита значителна корелация между такива генни сигнатури в нормална белодробна тъкан (r = 0,25, p = 0,06, Фигура 5f). Нокдаунът на SLC7A5 (Допълнителна Фигура 12) в клетки A549 значително намали клетъчните нива на триптофан и NAD(H) (Фигура 5g,h), което доведе до отслабена гликолитична активност, измерена чрез скоростта на извънклетъчно подкиселяване (ECAR) (Фигура 1). 5i). Следователно, въз основа на метаболитни промени в серума и in vitro откриване, ние предполагаме, че метаболизмът на триптофан може да произвежда NAD+ чрез кинурениновия път и да играе важна роля в насърчаването на гликолизата при рак на белия дроб.
Проучванията показват, че голям брой неопределени белодробни нодули, открити чрез LDCT, може да доведе до необходимост от допълнителни изследвания, като PET-CT, белодробна биопсия и прекомерно лечение поради фалшиво положителна диагноза за злокачествено заболяване.31 Както е показано на Фигура 6, нашето проучване идентифицира панел от серумни метаболити с потенциална диагностична стойност, които могат да подобрят стратификацията на риска и последващото лечение на белодробните нодули, открити чрез CT.
Белодробните нодули се оценяват с помощта на нискодозова компютърна томография (LDCT) с образни характеристики, предполагащи доброкачествени или злокачествени причини. Несигурният изход при нодулите може да доведе до чести последващи посещения, ненужни интервенции и прекомерно лечение. Включването на серумни метаболитни класификатори с диагностична стойност може да подобри оценката на риска и последващото лечение на белодробните нодули. PET позитронно-емисионна томография.
Данните от американското проучване NLST и европейското проучване NELSON показват, че скринингът на високорискови групи с нискодозова компютърна томография (LDCT) може да намали смъртността от рак на белия дроб1,3. Въпреки това, оценката на риска и последващото клинично управление на голям брой случайно открити белодробни нодули чрез LDCT остават най-предизвикателни. Основната цел е да се оптимизира правилната класификация на съществуващите протоколи, базирани на LDCT, чрез включване на надеждни биомаркери.
Някои молекулярни биомаркери, като например кръвни метаболити, са идентифицирани чрез сравняване на рак на белия дроб със здрави контроли15,17. В настоящото проучване се фокусирахме върху приложението на серумния метаболомен анализ, за да разграничим доброкачествените от злокачествените белодробни нодули, случайно открити чрез LDCT. Сравнихме глобалния серумен метаболом на проби от здрава контрола (HC), доброкачествени белодробни нодули (BN) и белодробен аденокарцином (LA) стадий I, използвайки UPLC-HRMS анализ. Установихме, че HC и BN имат сходни метаболитни профили, докато LA показва значителни промени в сравнение с HC и BN. Идентифицирахме два комплекта серумни метаболити, които диференцират LA от HC и BN.
Настоящата схема за идентификация на доброкачествени и злокачествени нодули, базирана на LDCT, се основава главно на размера, плътността, морфологията и скоростта на растеж на нодулите във времето30. Предишни проучвания показват, че размерът на нодулите е тясно свързан с вероятността от рак на белия дроб. Дори при пациенти с висок риск, рискът от злокачествено заболяване в лимфни възли <6 mm е <1%. Рискът от злокачествено заболяване за нодули с размери от 6 до 20 mm варира от 8% до 64%30. Следователно, Дружеството на Флайшнер препоръчва граничен диаметър от 6 mm за рутинно КТ проследяване.29 Въпреки това, оценката на риска и лечението на неопределени белодробни нодули (НБН) по-големи от 6 mm не са извършени адекватно31. Настоящото лечение на вродени сърдечни заболявания обикновено се основава на бдително чакане с често КТ наблюдение.
Въз основа на валидирания метаболом, за първи път демонстрирахме припокриването на метаболомните сигнатури между здрави индивиди и доброкачествени нодули <6 mm. Биологичното сходство е в съответствие с предишни КТ открития, че рискът от злокачествено заболяване при нодули <6 mm е толкова нисък, колкото и при пациенти без лимфни възли.30 Трябва да се отбележи, че нашите резултати също така показват, че доброкачествените нодули <6 mm и ≥6 mm имат високо сходство в метаболомните профили, което предполага, че функционалната дефиниция на доброкачествената етиология е последователна, независимо от размера на нодула. По този начин, съвременните диагностични серумни метаболитни панели могат да осигурят единичен анализ като тест за изключване, когато нодулите първоначално се открият на КТ и потенциално да намалят серийното наблюдение. В същото време, същият панел от метаболитни биомаркери разграничи злокачествените нодули ≥6 mm от доброкачествените нодули и предостави точни прогнози за интернивни неоплазми (IPN) с подобен размер и неясни морфологични характеристики на КТ изображения. Този класификатор на серумния метаболизъм се представи добре при прогнозиране на злокачественото заболяване на нодули ≥6 mm с AUC от 0,927. Взети заедно, нашите резултати показват, че уникалните серумни метаболомни сигнатури могат специфично да отразяват ранните туморно-индуцирани метаболитни промени и да имат потенциална стойност като предсказващи фактори за риска, независимо от размера на нодулите.
Трябва да се отбележи, че белодробният аденокарцином (LUAD) и плоскоклетъчният карцином (LUSC) са основните видове недребноклетъчен рак на белия дроб (NSCLC). Като се има предвид, че LUSC е силно свързан с употребата на тютюн47 и LUAD е най-честата хистология на случайни белодробни възли, открити при компютърна томография48, нашият класификатор е специално създаден за проби от аденокарцином в стадий I. Уанг и колеги също се фокусираха върху LUAD и идентифицираха девет липидни сигнатури, използвайки липидомика, за да разграничат рак на белия дроб в ранен стадий от здрави индивиди17. Тествахме настоящия класификатор върху 16 случая на LUSC в стадий I и 74 доброкачествени възли и наблюдавахме ниска точност на прогнозиране на LUSC (AUC 0,776), което предполага, че LUAD и LUSC може да имат свои собствени метаболомни сигнатури. Всъщност е доказано, че LUAD и LUSC се различават по етиология, биологичен произход и генетични аберации49. Следователно, други видове хистология трябва да бъдат включени в обучителните модели за популационно откриване на рак на белия дроб в скрининговите програми.
Тук идентифицирахме шестте най-често променени пътя при белодробен аденокарцином в сравнение със здрави контроли и доброкачествени нодули. Ксантинът и хипоксантинът са често срещани метаболити на пуриновия метаболитен път. В съответствие с нашите резултати, междинните продукти, свързани с пуриновия метаболизъм, бяха значително повишени в серума или тъканите на пациенти с белодробен аденокарцином в сравнение със здрави контроли или пациенти в преинвазивен стадий15,50. Повишените серумни нива на ксантин и хипоксантин може да отразяват анаболизма, необходим за бързо пролифериращите ракови клетки. Дисрегулацията на глюкозния метаболизъм е добре известен отличителен белег на раковия метаболизъм51. Тук наблюдавахме значително увеличение на пируват и лактат в групата на LA в сравнение с групата на HC и BN, което е в съответствие с предишни съобщения за аномалии на гликолитичния път в серумните метаболомни профили на пациенти с недребноклетъчен рак на белия дроб (NSCLC) и здрави контроли. Резултатите са последователни52,53.
Важно е да се отбележи, че наблюдавахме обратна корелация между метаболизма на пируват и триптофан в серума на белодробните аденокарциноми. Серумните нива на триптофан бяха намалени в групата с LA в сравнение с групата с HC или BN. Интересно е, че предишно мащабно проучване, използващо проспективна кохорта, установи, че ниските нива на циркулиращ триптофан са свързани с повишен риск от рак на белия дроб 54. Триптофанът е есенциална аминокиселина, която получаваме изцяло от храната. Заключаваме, че изчерпването на серумния триптофан при белодробния аденокарцином може да отразява бързото изчерпване на този метаболит. Добре известно е, че крайният продукт на катаболизма на триптофана чрез кинурениновия път е източникът на de novo синтез на NAD+. Тъй като NAD+ се произвежда предимно чрез пътя на спасяване, значението на NAD+ в метаболизма на триптофана в здравето и болестта все още не е определено 46. Нашият анализ на базата данни на TCGA показа, че експресията на триптофановия транспортер 7A5 (SLC7A5) е значително повишена при белодробен аденокарцином в сравнение с нормалните контроли и е положително корелирана с експресията на гликолитичния ензим GAPDH. Предишни проучвания са се фокусирали главно върху ролята на катаболизма на триптофана в потискането на антитуморния имунен отговор40,41,42. Тук ние демонстрираме, че инхибирането на усвояването на триптофан чрез нокдаун на SLC7A5 в раковите клетки на белия дроб води до последващо намаляване на клетъчните нива на NAD и съпътстващо отслабване на гликолитичната активност. В обобщение, нашето проучване предоставя биологична основа за промени в серумния метаболизъм, свързани със злокачествена трансформация на белодробен аденокарцином.
EGFR мутациите са най-честите драйверни мутации при пациенти с недребноклетъчен рак на белия дроб (NSCLC). В нашето проучване установихме, че пациенти с EGFR мутация (n = 41) имат общи метаболомни профили, подобни на пациенти с див тип EGFR (n = 31), въпреки че открихме намалени серумни нива на някои пациенти с EGFR мутация при пациенти с ацилкарнитин. Установената функция на ацилкарнитините е да транспортират ацилни групи от цитоплазмата в митохондриалната матрица, което води до окисление на мастни киселини за производство на енергия 55. В съответствие с нашите открития, скорошно проучване също така идентифицира подобни метаболомни профили между EGFR мутантните и EGFR див тип тумори чрез анализ на глобалния метаболом на 102 проби от тъкан на белодробен аденокарцином 50. Интересно е, че съдържанието на ацилкарнитин е установено и в групата с EGFR мутация. Следователно, дали промените в нивата на ацилкарнитин отразяват EGFR-индуцираните метаболитни промени и основните молекулярни пътища, може да заслужават по-нататъшно проучване.
В заключение, нашето проучване установява серумен метаболитен класификатор за диференциалната диагноза на белодробните нодули и предлага работен процес, който може да оптимизира оценката на риска и да улесни клиничното управление въз основа на скрининг с компютърна томография.
Това проучване е одобрено от Етичната комисия на Онкологичната болница към Университета Сун Ятсен, Първата филиална болница към Университета Сун Ятсен и Етичната комисия на Онкологичната болница към Университета Джънджоу. В групите за откриване и вътрешно валидиране са събрани 174 серума от здрави индивиди и 244 серума от доброкачествени нодули от индивиди, преминаващи годишни медицински прегледи в Отдела за контрол и превенция на рака към Онкологичния център към Университета Сун Ятсен, и 166 доброкачествени нодула. Белодробни аденокарциноми в стадий I са събрани от Онкологичния център към Университета Сун Ятсен. В кохортата за външно валидиране са открити 48 случая на доброкачествени нодули, 39 случая на белодробен аденокарцином в стадий I от Първата филиална болница към Университета Сун Ятсен и 24 случая на белодробен аденокарцином в стадий I от Онкологичната болница към Университета Джънджоу. Онкологичният център към Университета Сун Ятсен е събрал и 16 случая на плоскоклетъчен рак на белия дроб в стадий I, за да тества диагностичната способност на установения метаболитен класификатор (характеристиките на пациентите са показани в Допълнителна таблица 5). Проби от кохортата за откриване и кохортата за вътрешна валидация бяха събрани между януари 2018 г. и май 2020 г. Проби за кохортата за външна валидация бяха събрани между август 2021 г. и октомври 2022 г. За да се сведе до минимум половата предразсъдъчност, приблизително равен брой случаи от мъжки и женски пол бяха разпределени във всяка кохорта. Екип за откриване и екип за вътрешен преглед. Полът на участниците беше определен въз основа на самоотчет. От всички участници беше получено информирано съгласие и не беше предоставено обезщетение. Субектите с доброкачествени нодули бяха тези със стабилен резултат от компютърна томография на 2 до 5 години към момента на анализа, с изключение на 1 случай от пробата за външна валидация, който беше събран предоперативно и диагностициран чрез хистопатология. С изключение на хроничен бронхит. Случаите на белодробен аденокарцином бяха събрани преди резекция на белия дроб и потвърдени чрез патологична диагноза. Кръвни проби на гладно бяха събрани в епруветки за разделяне на серум без антикоагуланти. Кръвните проби бяха съсирени за 1 час при стайна температура и след това центрофугирани при 2851 × g за 10 минути при 4°C за събиране на серумния супернатант. Аликвотни проби от серума бяха замразени при -80°C до екстракция на метаболитите. Отделът за превенция на рака и медицински прегледи към Онкологичния център на университета Сун Ятсен събра серум от 100 здрави донори, включително равен брой мъже и жени на възраст от 40 до 55 години. Равни обеми от всяка донорска проба бяха смесени, полученият пул беше аликвотиран и съхраняван при -80°C. Серумната смес беше използвана като референтен материал за контрол на качеството и стандартизация на данните.
Референтният серум и тестовите проби бяха размразени и метаболитите бяха екстрахирани, използвайки комбиниран метод на екстракция (MTBE/метанол/вода) 56. Накратко, 50 μl серум беше смесен с 225 μl леденостуден метанол и 750 μl леденостуден метил трет-бутилов етер (MTBE). Разбъркайте сместа и инкубирайте върху лед в продължение на 1 час. След това пробите бяха смесени и разбъркани на вортекс с 188 μl вода с MS клас, съдържаща вътрешни стандарти (13C-лактат, 13C3-пируват, 13C-метионин и 13C6-изолевцин, закупени от Cambridge Isotope Laboratories). След това сместа беше центрофугирана при 15 000 × g за 10 минути при 4 °C и долната фаза беше прехвърлена в две епруветки (по 125 μL всяка) за LC-MS анализ в положителен и отрицателен режим. Накрая пробата беше изпарена до сухо състояние във високоскоростен вакуумен концентратор.
Изсушените метаболити бяха разтворени в 120 μl 80% ацетонитрил, разбъркани на вортекс в продължение на 5 минути и центрофугирани при 15 000 × g в продължение на 10 минути при 4°C. Супернатантите бяха прехвърлени в кехлибарени стъклени флакони с микровложки за метаболомни изследвания. Нецелеви метаболомен анализ на платформа за ултра-ефективна течна хроматография-масспектрометрия с висока резолюция (UPLC-HRMS). Метаболитите бяха разделени с помощта на Dionex Ultimate 3000 UPLC система и ACQUITY BEH Amide колона (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). В режим на положителни йони, мобилните фази бяха 95% (A) и 50% ацетонитрил (B), всяка от които съдържаше 10 mmol/L амониев ацетат и 0,1% мравчена киселина. В отрицателен режим, мобилните фази А и Б съдържаха съответно 95% и 50% ацетонитрил, като и двете фази съдържаха 10 mmol/L амониев ацетат, pH = 9. Градиентната програма беше следната: 0–0,5 мин, 2% B; 0,5–12 мин, 2–50% B; 12–14 мин, 50–98% B; 14–16 мин, 98% B; 16–16,1 мин, 98–2% B; 16,1–20 мин, 2% B. Колоната се поддържаше при 40°C, а пробата при 10°C в автосемплера. Дебитът беше 0,3 ml/min, инжекционният обем беше 3 μl. Масспектрометър Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) с източник на електроспрей йонизация (ESI) работеше в режим на пълно сканиране и беше свързан с режим на мониторинг ddMS2 за събиране на големи обеми данни. Параметрите на MS бяха зададени както следва: напрежение на пръскане +3.8 kV/- 3.2 kV, температура на капиляра 320°C, защитен газ 40 arb, спомагателен газ 10 arb, температура на нагревателя на сондата 350°C, обхват на сканиране 70–1050 m/h, резолюция 70 000. Данните бяха получени с помощта на Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
За да се оцени качеството на данните, бяха генерирани обединени проби за качествен контрол (QC) чрез вземане на 10 μL аликвотни части от супернатантата от всяка проба. В началото на аналитичната последователност бяха анализирани шест инжекции с проби за качествен контрол, за да се оцени стабилността на UPLC-MS системата. След това пробите за качествен контрол периодично се въвеждат в партидата. Всичките 11 партиди серумни проби в това проучване бяха анализирани чрез LC-MS. Аликвотни части от смес от серумни проби от 100 здрави донори бяха използвани като референтен материал в съответните партиди за наблюдение на процеса на екстракция и коригиране за ефектите от партидата до партида. Нецелеви метаболомичен анализ на кохортата за откриване, кохортата за вътрешна валидация и кохортата за външна валидация беше извършен в Метаболомичния център на Университета Сун Ятсен. Външната лаборатория на Центъра за анализ и тестване на Технологичния университет Гуандун също анализира 40 проби от външната кохорта, за да тества производителността на класификаторния модел.
След екстракция и реконституиране, абсолютното количествено определяне на серумните метаболити беше измерено с помощта на ултрависокоефективна течна хроматография-тандемна масспектрометрия (Agilent 6495 троен квадрупол) с източник на електроспрей йонизация (ESI) в режим на множествено реакционно наблюдение (MRM). За разделяне на метаболитите беше използвана колона ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters). Мобилната фаза се състоеше от 90% (A) и 5% ацетонитрил (B) с 10 mmol/L амониев ацетат и 0.1% разтвор на амоняк. Градиентната програма беше следната: 0–1.5 мин, 0% B; 1.5–6.5 мин, 0–15% B; 6.5–8 мин, 15% B; 8–8.5 мин, 15%–0% B; 8.5–11.5 мин, 0% B. Колоната се поддържаше при 40 °C, а пробата при 10 °C в автосамплера. Дебитът беше 0,3 mL/min, а инжектираният обем беше 1 μL. MS параметрите бяха зададени както следва: капилярно напрежение ±3,5 kV, налягане в пулверизатора 35 psi, поток на обвивния газ 12 L/min, температура на обвивния газ 350°C, температура на сушилния газ 250°C и поток на сушилния газ 14 l/min. MRM конверсиите на триптофан, пируват, лактат, хипоксантин и ксантин бяха съответно 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 и 151,0–107,9. Данните бяха събрани с помощта на Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). За серумните проби, триптофан, пируват, лактат, хипоксантин и ксантин бяха количествено определени с помощта на калибровъчни криви на стандартни смесени разтвори. За клетъчните проби съдържанието на триптофан беше нормализирано спрямо вътрешния стандарт и масата на клетъчния протеин.
Екстракцията на пикове (m/z и време на задържане (RT)) беше извършена с помощта на Compound Discovery 3.1 и TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). За да се елиминират потенциалните разлики между партидите, всеки характерен пик на тестваната проба беше разделен на характерния пик на референтния материал от същата партида, за да се получи относителното изобилие. Относителните стандартни отклонения на вътрешните стандарти преди и след стандартизацията са показани в Допълнителна таблица 6. Разликите между двете групи бяха характеризирани с процент на фалшиви открития (FDR<0.05, тест на ранговете на Wilcoxon със знаци) и промяна в кратността (>1.2 или <0.83). Суровите MS данни на извлечените характеристики и MS данните, коригирани за референтен серум, са показани съответно в Допълнителни данни 1 и Допълнителни данни 2. Анотацията на пиковете беше извършена въз основа на четири дефинирани нива на идентификация, включително идентифицирани метаболити, предполагаемо анотирани съединения, предполагаемо характеризирани класове съединения и неизвестни съединения 22. Въз основа на търсения в базата данни в Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), биологични съединения с MS/MS съответстващи валидирани стандарти или анотации за точно съвпадение в mzCloud (резултат > 85) или Chemspider бяха окончателно избрани като междинни продукти между диференциалния метаболом. Анотациите на пиковете за всяка характеристика са включени в Допълнителни данни 3. MetaboAnalyst 5.0 беше използван за еднофакторен анализ на сумарно нормализираното количество метаболити. MetaboAnalyst 5.0 също така оцени анализа за обогатяване на KEGG пътя въз основа на значително различни метаболити. Анализът на главните компоненти (PCA) и дискриминантният анализ на частичните най-малки квадрати (PLS-DA) бяха анализирани с помощта на софтуерния пакет ropls (v.1.26.4) с нормализиране на стека и автоматично мащабиране. Оптималният модел на метаболитен биомаркер за прогнозиране на злокачественост на нодулите беше генериран с помощта на бинарна логистична регресия с най-малко абсолютно свиване и оператор за селекция (LASSO, R пакет v.4.1-3). Производителността на дискриминантния модел в наборите за детекция и валидация беше характеризирана чрез оценка на AUC въз основа на ROC анализ съгласно пакета pROC (v.1.18.0.). Оптималното гранично значение на вероятността беше получено въз основа на максималния индекс на Youden на модела (чувствителност + специфичност – 1). Пробите със стойности по-малки или по-големи от прага ще бъдат предсказани съответно като доброкачествени нодули и белодробен аденокарцином.
Клетки A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) бяха култивирани в F-12K среда, съдържаща 10% FBS. В лентивирусния вектор pLKO.1-puro бяха вмъкнати късо-фиберни РНК (shRNA) секвенции, насочени към SLC7A5, и нетаргетираща контрола (NC). Антисенс секвенциите на shSLC7A5 са следните: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Антитела към SLC7A5 (#5347) и тубулин (#2148) бяха закупени от Cell Signaling Technology. Антитела към SLC7A5 и тубулин бяха използвани в разреждане 1:1000 за Western blot анализ.
Тестът за гликолитичен стрес Seahorse XF измерва нивата на извънклетъчно подкиселяване (ECAR). В анализа глюкоза, олигомицин А и 2-DG бяха прилагани последователно, за да се тества клетъчният гликолитичен капацитет, измерен чрез ECAR.
Клетки A549, трансфектирани с нетаргетиращ контрол (NC) и shSLC7A5 (Sh1, Sh2), бяха поставени за една нощ в блюда с диаметър 10 cm. Клетъчните метаболити бяха екстрахирани с 1 ml леденостуден 80% воден метанол. Клетките в метаноловия разтвор бяха остъргани, събрани в нова епруветка и центрофугирани при 15 000 × g за 15 минути при 4°C. Съберете 800 µl супернатанта и изсушете с помощта на високоскоростен вакуумен концентратор. Изсушените метаболитни пелети след това бяха анализирани за нива на триптофан, използвайки LC-MS/MS, както е описано по-горе. Клетъчните нива на NAD(H) в клетки A549 (NC и shSLC7A5) бяха измерени с помощта на количествен колориметричен комплект NAD+/NADH (#K337, BioVision) съгласно инструкциите на производителя. Нивата на протеин бяха измерени за всяка проба, за да се нормализира количеството на метаболитите.
Не са използвани статистически методи за предварително определяне на размера на извадката. Предишни метаболомни изследвания, насочени към откриване на биомаркери15,18, са били разглеждани като еталони за определяне на размера и в сравнение с тези доклади, нашата извадка е била адекватна. Не са били изключени проби от изследваната кохорта. Серумните проби са били разпределени на случаен принцип в група за откриване (306 случая, 74,6%) и група за вътрешна валидация (104 случая, 25,4%) за нецелеви метаболомни изследвания. Също така, на случаен принцип са избрани 70 случая от всяка група от набора за откриване за целеви метаболомни изследвания. Изследователите са били заслепени за разпределението на групите по време на събирането и анализа на LC-MS данни. Статистическите анализи на метаболомни данни и клетъчни експерименти са описани в съответните раздели „Резултати“, „Легенди към фигурите“ и „Методи“. Количественото определяне на клетъчния триптофан, NADT и гликолитичната активност е извършено три пъти независимо с идентични резултати.
За повече информация относно дизайна на изследването вижте резюмето на доклада за естественото портфолио, свързано с тази статия.
Суровите MS данни на извлечените характеристики и нормализираните MS данни на референтния серум са показани съответно в Допълнителни данни 1 и Допълнителни данни 2. Анотациите на пиковете за диференциалните характеристики са представени в Допълнителни данни 3. Наборът от данни LUAD TCGA може да бъде изтеглен от https://portal.gdc.cancer.gov/. Входните данни за начертаване на графиката са предоставени в изходните данни. Изходните данни са предоставени за тази статия.
Национална изследователска група за белодробен скрининг и др. Намаляване на смъртността от рак на белия дроб с нискодозова компютърна томография. Северна Англия. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR и Prophet, PC Скрининг за рак на белия дроб с помощта на нискодозова спирална компютърна томография: резултати от Националното проучване за скрининг на белия дроб (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
Де Конинг, Х. Дж. и др. Намаляване на смъртността от рак на белия дроб с обемен компютърен томографски скрининг в рандомизирано проучване. Северна Англия. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Време на публикуване: 18 септември 2023 г.