Диференциалната диагноза на белодробни възли, идентифицирани чрез компютърна томография (КТ), остава предизвикателство в клиничната практика.Тук характеризираме глобалния метаболом на 480 серумни проби, включително здрави контроли, доброкачествени белодробни възли и стадий I на белодробен аденокарцином.Аденокарциномите показват уникални метаболомни профили, докато доброкачествените възли и здравите индивиди имат голямо сходство в метаболомните профили.В групата за откриване (n = 306) беше идентифициран набор от 27 метаболита за разграничаване между доброкачествени и злокачествени възли.AUC на дискриминантния модел в групите за вътрешно валидиране (n = 104) и външно валидиране (n = 111) е съответно 0,915 и 0,945.Анализът на пътя разкрива повишени гликолитични метаболити, свързани с намален триптофан в белодробен аденокарциномен серум в сравнение с доброкачествени възли и здрави контроли, и предполага, че усвояването на триптофан насърчава гликолизата в раковите клетки на белия дроб.Нашето проучване подчертава стойността на серумните метаболитни биомаркери при оценката на риска от белодробни възли, открити чрез КТ.
Ранната диагностика е от решаващо значение за подобряване на процента на преживяемост при пациенти с рак.Резултатите от Националното проучване за скрининг на рак на белия дроб в САЩ (NLST) и европейското проучване на NELSON показват, че скринингът с нискодозова компютърна томография (LDCT) може значително да намали смъртността от рак на белия дроб във високорискови групи1,2,3.След широкото използване на LDCT за скрининг на рак на белия дроб, честотата на случайни рентгенографски находки на асимптоматични белодробни възли продължава да нараства 4 .Белодробните възли се определят като фокални непрозрачности до 3 cm в диаметър 5 .Изправени сме пред трудности при оценката на вероятността от злокачествено заболяване и справянето с големия брой белодробни възли, открити случайно при LDCT.Ограниченията на КТ могат да доведат до чести последващи прегледи и фалшиво положителни резултати, водещи до ненужна намеса и свръхлечение6.Следователно има нужда от разработване на надеждни и полезни биомаркери за правилно идентифициране на белодробния рак в ранните стадии и разграничаване на повечето доброкачествени възли при първоначално откриване 7 .
Изчерпателният молекулярен анализ на кръв (серум, плазма, мононуклеарни клетки от периферна кръв), включително геномика, протеомика или ДНК метилиране 8, 9, 10, доведе до нарастващ интерес към откриването на диагностични биомаркери за рак на белия дроб.Междувременно метаболомичните подходи измерват клетъчните крайни продукти, които се влияят от ендогенни и екзогенни действия и следователно се прилагат за прогнозиране на началото и изхода на заболяването.Течна хроматография-тандемна масспектрометрия (LC-MS) е широко използван метод за метаболомични изследвания поради високата си чувствителност и голям динамичен диапазон, който може да покрие метаболити с различни физикохимични свойства11,12,13.Въпреки че глобалният метаболомен анализ на плазма/серум е бил използван за идентифициране на биомаркери, свързани с диагнозата на рак на белия дроб 14, 15, 16, 17 и ефикасността на лечението, 18 серумните метаболитни класификатори за разграничаване между доброкачествени и злокачествени белодробни възли остават да бъдат много проучени.-мащабни изследвания.
Аденокарциномът и плоскоклетъчният карцином са двата основни подтипа на недребноклетъчен рак на белия дроб (NSCLC).Различни CT скринингови тестове показват, че аденокарциномът е най-честият хистологичен тип рак на белия дроб1,19,20,21.В това проучване използвахме ултра-ефективна течна хроматография с висока разделителна способност масспектрометрия (UPLC-HRMS), за да извършим метаболомичен анализ на общо 695 серумни проби, включително здрави контроли, доброкачествени белодробни възли и CT-открити ≤3 cm.Скрининг за стадий I на белодробен аденокарцином.Идентифицирахме панел от серумни метаболити, които разграничават белодробния аденокарцином от доброкачествени възли и здрави контроли.Анализът на обогатяването на пътя разкрива, че анормалният метаболизъм на триптофан и глюкоза са често срещани промени в белодробния аденокарцином в сравнение с доброкачествени възли и здрави контроли.И накрая, създадохме и валидирахме серумен метаболитен класификатор с висока специфичност и чувствителност за разграничаване между злокачествени и доброкачествени белодробни възли, открити от LDCT, което може да помогне при ранна диференциална диагноза и оценка на риска.
В настоящото проучване серумни проби, съответстващи на пола и възрастта, бяха събрани ретроспективно от 174 здрави контроли, 292 пациенти с доброкачествени белодробни възли и 229 пациенти с белодробен аденокарцином в стадий I.Демографските характеристики на 695 субекта са показани в допълнителна таблица 1.
Както е показано на Фигура 1а, общо 480 серумни проби, включително 174 здрави контроли (HC), 170 доброкачествени възли (BN) и 136 проби от стадий I на белодробен аденокарцином (LA), бяха събрани в Cancer Center на университета Sun Yat-sen.Кохорта за откриване за ненасочено метаболомно профилиране с помощта на ултра-ефективна течна хроматография с висока разделителна способност мас спектрометрия (UPLC-HRMS).Както е показано на допълнителна фигура 1, диференциалните метаболити между LA и HC, LA и BN бяха идентифицирани, за да се установи класификационен модел и допълнително да се изследва диференциалният анализ на пътя.104 проби, събрани от раковия център на университета Сун Ятсен, и 111 проби, събрани от две други болници, бяха подложени съответно на вътрешно и външно валидиране.
Проучвана популация в кохортата за откриване, която е подложена на глобален серумен метаболомичен анализ с помощта на свръхефективна течна хроматография с висока разделителна способност (UPLC-HRMS).b Частичен дискриминантен анализ на най-малките квадрати (PLS-DA) на общия метаболом на 480 серумни проби от кохортата на изследването, включително здрави контроли (HC, n = 174), доброкачествени възли (BN, n = 170) и стадий I на белодробен аденокарцином (Лос Анджелис, n = 136).+ESI, положителен режим на йонизация с електроспрей, -ESI, режим на отрицателна йонизация с електроспрей.c–e Метаболитите със значително различно изобилие в две дадени групи (двустранен рангов тест на Wilcoxon, коригирана p стойност на фалшиви открития, FDR <0,05) са показани в червено (кратна промяна > 1,2) и синьо (кратна промяна <0,83) .), показани на графиката на вулкана.f Топлинна карта на йерархично групиране, показваща значителни разлики в броя на анотираните метаболити между LA и BN.Изходните данни се предоставят под формата на файлове с изходни данни.
Общият серумен метаболом от 174 HC, 170 BN и 136 LA в групата за откриване беше анализиран с помощта на UPLC-HRMS анализ.Първо показваме, че пробите за контрол на качеството (QC) се групират плътно в центъра на неконтролиран модел за анализ на главните компоненти (PCA), потвърждавайки стабилността на представянето на настоящото изследване (допълнителна фигура 2).
Както е показано в дискриминантния анализ на частични най-малки квадрати (PLS-DA) на фигура 1 b, ние открихме, че има ясни разлики между LA и BN, LA и HC в положителни (+ESI) и отрицателни (−ESI) режими на йонизация с електроспрей .изолиран.Въпреки това, не са открити значителни разлики между BN и HC в +ESI и -ESI условия.
Открихме 382 диференциални характеристики между LA и HC, 231 диференциални характеристики между LA и BN и 95 диференциални характеристики между BN и HC (Wilcoxon signed rank test, FDR <0,05 и множествена промяна >1,2 или <0,83) (Фигура .1c-e )..Пиковете бяха допълнително анотирани (допълнителни данни 3) спрямо база данни (mzCloud/HMDB/Chemspider библиотека) чрез m/z стойност, време на задържане и търсене в масовия спектър на фрагментация (подробности описани в раздел Методи) 22.И накрая, 33 и 38 анотирани метаболита със значителни разлики в изобилието бяха идентифицирани съответно за LA спрямо BN (Фигура 1f и допълнителна таблица 2) и LA срещу HC (допълнителна фигура 3 и допълнителна таблица 2).За разлика от това, само 3 метаболита със значителни разлики в изобилието бяха идентифицирани в BN и HC (допълнителна таблица 2), в съответствие с припокриването между BN и HC в PLS-DA.Тези диференциални метаболити покриват широк спектър от биохимикали (допълнителна фигура 4).Взети заедно, тези резултати показват значителни промени в серумния метаболом, които отразяват злокачествена трансформация на рак на белия дроб в ранен стадий в сравнение с доброкачествени белодробни възли или здрави индивиди.Междувременно, сходството на серумния метаболом на BN и HC предполага, че доброкачествените белодробни възли могат да споделят много биологични характеристики със здрави индивиди.Като се има предвид, че генните мутации на рецептора на епидермалния растежен фактор (EGFR) са често срещани в белодробен аденокарцином подтип 23, ние се опитахме да определим въздействието на мутациите на водача върху серумния метаболом.След това анализирахме общия метаболомичен профил на 72 случая с EGFR статус в групата с белодробен аденокарцином.Интересното е, че открихме сравними профили между пациенти с EGFR мутанти (n = 41) и пациенти с див тип EGFR (n = 31) в PCA анализ (допълнителна фигура 5а).Въпреки това, ние идентифицирахме 7 метаболита, чието изобилие беше значително променено при пациенти с EGFR мутация в сравнение с пациенти с див тип EGFR (t тест, p <0,05 и кратна промяна> 1,2 или <0,83) (допълнителна фигура 5b).Повечето от тези метаболити (5 от 7) са ацилкарнитини, които играят важна роля в пътищата на окисляване на мастни киселини.
Както е илюстрирано в работния процес, показан на Фигура 2 а, биомаркерите за класификация на нодулите са получени с помощта на оператори за най-малко абсолютно свиване и селекция на базата на 33 диференциални метаболита, идентифицирани в LA (n = 136) и BN (n = 170).Най-добра комбинация от променливи (LASSO) – бинарен логистичен регресионен модел.За тестване на надеждността на модела беше използвано десеткратно кръстосано валидиране.Изборът на променливи и регулирането на параметъра се коригират чрез наказание за максимизиране на вероятността с параметър λ24.Глобалният метаболомичен анализ беше допълнително извършен независимо в групите за вътрешно валидиране (n = 104) и външно валидиране (n = 111), за да се тества ефективността на класификацията на дискриминантния модел.В резултат на това 27 метаболита в набора за откриване бяха идентифицирани като най-добрия дискриминантен модел с най-голямата средна стойност на AUC (фиг. 2b), сред които 9 имат повишена активност и 18 намалена активност в LA в сравнение с BN (фиг. 2c).
Работен процес за изграждане на класификатор на белодробни нодули, включително избор на най-добрия панел от серумни метаболити в набора за откриване с помощта на бинарен логистичен регресионен модел чрез десетократно кръстосано валидиране и оценка на предсказуемото представяне във вътрешни и външни комплекти за валидиране.b Статистика за кръстосано валидиране на регресионен модел LASSO за избор на метаболитен биомаркер.Дадените по-горе числа представляват средния брой биомаркери, избрани при даден λ.Червената пунктирана линия представлява средната стойност на AUC при съответната ламбда.Сивите ленти за грешки представляват минималните и максималните стойности на AUC.Пунктираната линия показва най-добрия модел с 27 избрани биомаркера.AUC, площ под кривата на работната характеристика на приемника (ROC).c Кратни промени на 27 избрани метаболита в групата LA в сравнение с групата BN в групата за откриване.Червена колона – активиране.Синята колона е спад.d–f Криви на работната характеристика на приемника (ROC), показващи мощността на дискриминантния модел, базиран на 27 метаболитни комбинации в комплектите за откриване, вътрешно и външно валидиране.Изходните данни се предоставят под формата на файлове с изходни данни.
Създаден е прогнозен модел въз основа на претеглените регресионни коефициенти на тези 27 метаболита (допълнителна таблица 3).ROC анализът, базиран на тези 27 метаболита, дава стойност на площ под кривата (AUC) от 0,933, чувствителността на групата за откриване е 0,868, а специфичността е 0,859 (фиг. 2d).Междувременно, сред 38-те анотирани диференциални метаболита между LA и HC, набор от 16 метаболита постигна AUC от 0.902 с чувствителност от 0.801 и специфичност от 0.856 при разграничаване на LA от HC (допълнителна фигура 6a-c).Стойностите на AUC, базирани на различни прагове на промяна на пъти за различни метаболити, също бяха сравнени.Ние открихме, че класификационният модел се представя най-добре при разграничаване между LA и BN (HC), когато нивото на промяна на сгъването е зададено на 1,2 спрямо 1,5 или 2,0 (допълнителна фигура 7a, b).Класификационният модел, базиран на 27 метаболитни групи, беше допълнително валидиран във вътрешни и външни кохорти.AUC е 0,915 (чувствителност 0,867, специфичност 0,811) за вътрешно валидиране и 0,945 (чувствителност 0,810, специфичност 0,979) за външно валидиране (фиг. 2e, f).За да се оцени междулабораторната ефективност, 40 проби от външната кохорта бяха анализирани във външна лаборатория, както е описано в раздела Методи.Точността на класификацията постигна AUC от 0,925 (допълнителна фигура 8).Тъй като белодробният плоскоклетъчен карцином (LUSC) е вторият най-често срещан подтип на недребноклетъчен белодробен рак (NSCLC) след белодробния аденокарцином (LUAD), ние също тествахме валидираната потенциална полезност на метаболитните профили.BN и 16 случая на LUSC.AUC на дискриминация между LUSC и BN е 0,776 (допълнителна фигура 9), което показва по-слаба способност в сравнение с дискриминацията между LUAD и BN.
Проучванията показват, че размерът на нодулите върху КТ изображения е в положителна корелация с вероятността от злокачествено заболяване и остава основен определящ фактор за лечението на нодулите25,26,27.Анализът на данните от голямата кохорта от скрининговото проучване на NELSON показа, че рискът от злокачествено заболяване при субекти с възли <5 mm е дори подобен на този при субекти без възли 28 .Следователно минималният размер, изискващ редовно КТ наблюдение, е 5 mm, както се препоръчва от Британското торакално дружество (BTS), и 6 mm, както се препоръчва от Fleischner Society 29 .Нодулите, по-големи от 6 mm и без очевидни доброкачествени характеристики, наречени неопределени белодробни възли (IPN), остават основно предизвикателство при оценката и управлението в клиничната практика30,31.След това проверихме дали размерът на нодулите е повлиял на метаболомните сигнатури, използвайки сборни проби от кохортите за откриване и вътрешно валидиране.Фокусирайки се върху 27 валидирани биомаркера, първо сравнихме PCA профилите на HC и BN под-6 mm метаболоми.Ние открихме, че повечето от точките от данни за HC и BN се припокриват, демонстрирайки, че нивата на серумния метаболит са сходни и в двете групи (фиг. 3а).Картите на характеристиките в различни размери остават запазени в BN и LA (фиг. 3b, c), докато се наблюдава разделяне между злокачествени и доброкачествени възли в диапазона 6–20 mm (фиг. 3d).Тази кохорта има AUC от 0,927, специфичност от 0,868 и чувствителност от 0,820 за предсказване на злокачествеността на възли с размери от 6 до 20 mm (фиг. 3e, f).Нашите резултати показват, че класификаторът може да улови метаболитни промени, причинени от ранна злокачествена трансформация, независимо от размера на възела.
ad Сравнение на PCA профили между определени групи въз основа на метаболитен класификатор от 27 метаболита.CC и BN < 6 mm.b BN < 6 mm срещу BN 6–20 mm.в LA 6–20 mm срещу LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm и LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Крива на работната характеристика на приемника (ROC), показваща характеристиките на дискриминантния модел за нодули 6–20 mm.f Стойностите на вероятността са изчислени въз основа на логистичния регресионен модел за нодули с размери 6–20 mm.Сивата пунктирана линия представлява оптималната гранична стойност (0,455).Цифрите по-горе представляват процента на предвидените случаи за Лос Анджелис.Използвайте двустранен t тест на Student.PCA, анализ на главните компоненти.AUC площ под кривата.Изходните данни се предоставят под формата на файлове с изходни данни.
Четири проби (на възраст 44–61 години) с подобни размери на белодробни възли (7–9 mm) бяха допълнително избрани, за да илюстрират ефективността на предложения модел за прогнозиране на злокачествени заболявания (Фиг. 4a, b).При първоначалния скрининг Случай 1 се представя като солиден възел с калцификация, характеристика, свързана с доброкачественост, докато Случай 2 се представя като неопределен частично солиден възел без очевидни доброкачествени характеристики.Три кръга от последващи компютърни томографии показват, че тези случаи остават стабилни за период от 4 години и следователно се считат за доброкачествени възли (фиг. 4а).В сравнение с клиничната оценка на серийни CT сканирания, еднократният серумен метаболитен анализ с настоящия модел на класификатор бързо и правилно идентифицира тези доброкачествени възли въз основа на вероятностни ограничения (Таблица 1).Фигура 4b в случай 3 показва възел с признаци на плеврална ретракция, което най-често се свързва със злокачествено заболяване32.Случай 4 се представя като неопределен частично солиден възел без доказателства за доброкачествена причина.Всички тези случаи са прогнозирани като злокачествени според модела на класификатора (Таблица 1).Оценката на белодробния аденокарцином беше демонстрирана чрез хистопатологично изследване след операция за белодробна резекция (фиг. 4b).За комплекта за външно валидиране метаболитният класификатор точно прогнозира два случая на неопределени белодробни възли, по-големи от 6 mm (допълнителна фигура 10).
КТ изображения на аксиалния прозорец на белите дробове на два случая на доброкачествени възли.В случай 1, компютърната томография след 4 години показа стабилен солиден възел с размери 7 mm с калцификация в десния долен лоб.В случай 2, компютърна томография след 5 години разкри стабилен, частично солиден възел с диаметър 7 mm в десния горен лоб.b КТ изображения на белите дробове в аксиален прозорец и съответните патологични изследвания на два случая на аденокарцином в стадий I преди белодробна резекция.Случай 3 разкрива възел с диаметър 8 mm в десния горен лоб с плеврална ретракция.Случай 4 разкри частично солиден възел от шлифовано стъкло с размери 9 mm в левия горен лоб.Оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) на резецирана белодробна тъкан (скала = 50 μm), демонстрираща модела на ацинарен растеж на белодробен аденокарцином.Стрелките показват възли, открити на КТ изображения.H&E изображенията са представителни изображения на множество (>3) микроскопични полета, изследвани от патолога.
Взети заедно, нашите резултати демонстрират потенциалната стойност на серумните метаболитни биомаркери в диференциалната диагноза на белодробни възли, което може да създаде предизвикателства при оценката на КТ скрининга.
Въз основа на валидиран диференциален метаболитен панел, ние се опитахме да идентифицираме биологични корелати на основните метаболитни промени.Анализът на обогатяването на пътя на KEGG от MetaboAnalyst идентифицира 6 често срещани значително променени пътя между двете дадени групи (LA срещу HC и LA срещу BN, коригирано p ≤ 0,001, ефект > 0,01).Тези промени се характеризират с нарушения в метаболизма на пируват, метаболизма на триптофан, метаболизма на ниацин и никотинамид, гликолизата, цикъла на ТСА и метаболизма на пурин (фиг. 5а).След това допълнително извършихме целенасочена метаболомика, за да проверим големи промени, използвайки абсолютно количествено определяне.Определяне на обичайните метаболити в често променени пътища чрез тройна квадруполна масспектрометрия (QQQ), използвайки автентични метаболитни стандарти.Демографските характеристики на целевата проба на изследването на метаболомиката са включени в допълнителна таблица 4. В съответствие с нашите глобални метаболомични резултати, количественият анализ потвърди, че хипоксантинът и ксантинът, пируватът и лактатът са повишени в LA в сравнение с BN и HC (фиг. 5b, c, р <0,05).Въпреки това, не са открити значителни разлики в тези метаболити между BN и HC.
Анализ на обогатяване на KEGG пътя на значително различни метаболити в LA групата в сравнение с BN и HC групите.Използван е двустранен глобален тест и стойностите на p са коригирани с помощта на метода на Holm-Bonferroni (коригирано p ≤ 0,001 и размер на ефекта > 0,01).b–d Графики на Violin, показващи нива на хипоксантин, ксантин, лактат, пируват и триптофан в серумните HC, BN и LA, определени чрез LC-MS/MS (n = 70 за група).Белите и черните пунктирани линии показват съответно медианата и квартила.e Диаграма на Violin, показваща нормализирана експресия на Log2TPM (транскрипти на милион) на mRNA на SLC7A5 и QPRT в белодробен аденокарцином (n = 513) в сравнение с нормална белодробна тъкан (n = 59) в набора от данни LUAD-TCGA.Бялата кутия представлява интерквартилния диапазон, хоризонталната черна линия в центъра представлява медианата, а вертикалната черна линия, простираща се от кутията, представлява 95% доверителен интервал (CI).f Корелационна диаграма на Pearson на експресията на SLC7A5 и GAPDH в белодробен аденокарцином (n = 513) и нормална белодробна тъкан (n = 59) в набора от данни на TCGA.Сивата зона представлява 95% CI.r, коефициент на корелация на Pearson.g Нормализирани нива на клетъчен триптофан в A549 клетки, трансфектирани с неспецифична shRNA контрола (NC) и shSLC7A5 (Sh1, Sh2), определени чрез LC-MS/MS.Представен е статистически анализ на пет биологично независими проби във всяка група.h Клетъчни нива на NADt (общо NAD, включително NAD+ и NADH) в A549 клетки (NC) и SLC7A5 нокдаун A549 клетки (Sh1, Sh2).Представен е статистически анализ на три биологично независими проби от всяка група.i Гликолитичната активност на A549 клетки преди и след нокдаун на SLC7A5 беше измерена чрез скорост на екстрацелуларно подкисляване (ECAR) (n = 4 биологично независими проби на група).2-DG,2-дезокси-D-глюкоза.Двустранният t тест на Student е използван в (b–h).В (g–i) лентите за грешки представляват средната стойност ± SD, всеки експеримент беше извършен три пъти независимо и резултатите бяха подобни.Изходните данни се предоставят под формата на файлове с изходни данни.
Като се има предвид значителното въздействие на променения метаболизъм на триптофан в групата на LA, ние също оценихме серумните нива на триптофан в групите HC, BN и LA, използвайки QQQ.Установихме, че серумният триптофан е намален в LA в сравнение с HC или BN (p <0,001, Фигура 5d), което е в съответствие с предишни констатации, че нивата на циркулиращия триптофан са по-ниски при пациенти с рак на белия дроб, отколкото при здрави контроли от контролната група33,34 ,35.Друго проучване, използващо PET/CT индикатор 11C-метил-L-триптофан, установи, че времето за задържане на сигнала на триптофан в тъканта на рак на белия дроб е значително увеличено в сравнение с доброкачествени лезии или нормална тъкан36.Ние предполагаме, че намаляването на триптофан в серума на LA може да отразява активното усвояване на триптофан от раковите клетки на белия дроб.
Известно е също, че крайният продукт на кинурениновия път на катаболизма на триптофан е NAD+37,38, който е важен субстрат за реакцията на глицералдехид-3-фосфат с 1,3-бисфосфоглицерат при гликолиза39.Докато предишни проучвания са фокусирани върху ролята на катаболизма на триптофан в имунната регулация, ние се опитахме да изясним взаимодействието между дисрегулацията на триптофан и гликолитичните пътища, наблюдавани в настоящото проучване.Известно е, че член 5 от фамилия 7 на преносител на разтворени вещества (SLC7A5) е преносител на триптофан 43, 44, 45.Фосфорибозилтрансферазата на хинолиновата киселина (QPRT) е ензим, разположен надолу по веригата на кинурениновия път, който превръща хинолиновата киселина в NAMN46.Проверката на набора от данни LUAD TCGA разкри, че както SLC7A5, така и QPRT са значително повишени в туморната тъкан в сравнение с нормалната тъкан (фиг. 5e).Това увеличение се наблюдава в етапи I и II, както и етапи III и IV на белодробен аденокарцином (допълнителна фигура 11), което показва ранни нарушения в метаболизма на триптофана, свързани с туморогенезата.
В допълнение, наборът от данни LUAD-TCGA показа положителна корелация между експресията на SLC7A5 и GAPDH mRNA в проби от пациенти с рак (r = 0,45, p = 1,55E-26, Фигура 5f).Обратно, не е открита значителна корелация между такива генни сигнатури в нормалната белодробна тъкан (r = 0.25, p = 0.06, Фигура 5f).Нокдаунът на SLC7A5 (допълнителна фигура 12) в A549 клетки значително намалява нивата на клетъчния триптофан и NAD(H) (Фигура 5g,h), което води до отслабена гликолитична активност, измерена чрез скорост на екстрацелуларно подкисляване (ECAR) (Фигура 1).5i).По този начин, въз основа на метаболитни промени в серума и откриване in vitro, ние предполагаме, че метаболизмът на триптофан може да произведе NAD+ през кинурениновия път и да играе важна роля в насърчаването на гликолизата при рак на белия дроб.
Проучванията показват, че голям брой неопределени белодробни възли, открити чрез LDCT, могат да доведат до необходимост от допълнителни изследвания като PET-CT, белодробна биопсия и свръхлечение поради фалшиво положителна диагноза за злокачествено заболяване.31 Както е показано на Фигура 6, нашето проучване идентифицира група от серумни метаболити с потенциална диагностична стойност, която може да подобри стратификацията на риска и последващото управление на белодробни възли, открити чрез КТ.
Белодробните възли се оценяват с помощта на нискодозова компютърна томография (LDCT) с образни характеристики, предполагащи доброкачествени или злокачествени причини.Несигурният резултат от възлите може да доведе до чести последващи посещения, ненужни интервенции и прекомерно лечение.Включването на серумни метаболитни класификатори с диагностична стойност може да подобри оценката на риска и последващото управление на белодробните възли.PET позитронно-емисионна томография.
Данните от проучването NLST в САЩ и европейското проучване NELSON предполагат, че скринингът на високорискови групи с нискодозова компютърна томография (LDCT) може да намали смъртността от рак на белия дроб1,3.Въпреки това, оценката на риска и последващото клинично управление на голям брой случайни белодробни възли, открити от LDCT, остават най-предизвикателни.Основната цел е да се оптимизира правилната класификация на съществуващите базирани на LDCT протоколи чрез включване на надеждни биомаркери.
Някои молекулярни биомаркери, като кръвни метаболити, са идентифицирани чрез сравняване на рак на белия дроб със здрави контроли15,17.В настоящото проучване ние се фокусирахме върху прилагането на серумен метаболомичен анализ за разграничаване между доброкачествени и злокачествени белодробни възли, случайно открити от LDCT.Сравнихме глобалния серумен метаболом на здрава контрола (HC), доброкачествени белодробни възли (BN) и белодробен аденокарцином (LA) в стадий I, използвайки UPLC-HRMS анализ.Открихме, че HC и BN имат подобни метаболитни профили, докато LA показва значителни промени в сравнение с HC и BN.Ние идентифицирахме два комплекта серумни метаболити, които разграничават LA от HC и BN.
Настоящата схема за идентифициране на доброкачествени и злокачествени възли, базирана на LDCT, се основава главно на размера, плътността, морфологията и скоростта на растеж на възлите във времето30.Предишни проучвания показват, че размерът на възлите е тясно свързан с вероятността от рак на белия дроб.Дори при пациенти с висок риск, рискът от злокачествено заболяване при възли <6 mm е <1%.Рискът от злокачествено заболяване при възли с размери от 6 до 20 mm варира от 8% до 64%30.Поради това Fleischner Society препоръчва граничен диаметър от 6 mm за рутинно КТ проследяване.29 Въпреки това оценката на риска и управлението на неопределени белодробни възли (IPN), по-големи от 6 mm, не са извършени адекватно 31 .Текущото управление на вроденото сърдечно заболяване обикновено се основава на бдително изчакване с често КТ наблюдение.
Въз основа на валидирания метаболом, ние демонстрирахме за първи път припокриването на метаболомните сигнатури между здрави индивиди и доброкачествени възли <6 mm.Биологичното сходство е в съответствие с предишни констатации на КТ, че рискът от злокачествено заболяване за възли <6 mm е толкова нисък, колкото и при субекти без възли.30 Трябва да се отбележи, че нашите резултати също показват, че доброкачествените възли <6 mm и ≥6 mm имат висока сходство в метаболомните профили, което предполага, че функционалната дефиниция на доброкачествена етиология е последователна, независимо от размера на възела.По този начин съвременните диагностични серумни метаболитни панели могат да осигурят единичен анализ като тест за изключване, когато нодулите се открият първоначално при КТ и потенциално да намалят серийния мониторинг.В същото време същият панел от метаболитни биомаркери разграничава злокачествени възли с размер ≥6 mm от доброкачествени възли и предоставя точни прогнози за IPN с подобен размер и двусмислени морфологични характеристики на CT изображения.Този класификатор на серумния метаболизъм се представи добре при прогнозиране на злокачествеността на възли ≥6 mm с AUC от 0,927.Взети заедно, нашите резултати показват, че уникалните серумни метаболомични сигнатури могат специфично да отразяват ранните индуцирани от тумор метаболитни промени и да имат потенциална стойност като предиктори на риска, независимо от размера на нодулите.
Трябва да се отбележи, че белодробният аденокарцином (LUAD) и плоскоклетъчният карцином (LUSC) са основните видове недребноклетъчен рак на белия дроб (NSCLC).Като се има предвид, че LUSC е силно свързан с употребата на тютюн47 и LUAD е най-честата хистология на случайни белодробни възли, открити при CT скрининг48, нашият модел на класификатор е специално създаден за проби от аденокарцином в стадий I.Уанг и колегите също се фокусираха върху LUAD и идентифицираха девет липидни сигнатури, използвайки липидомици, за да разграничат рак на белия дроб в ранен стадий от здрави индивиди17.Тествахме настоящия модел на класификатор върху 16 случая на стадий I LUSC и 74 доброкачествени възли и наблюдавахме ниска точност на прогнозиране на LUSC (AUC 0,776), което предполага, че LUAD и LUSC може да имат свои собствени метаболомични сигнатури.Наистина е доказано, че LUAD и LUSC се различават по етиология, биологичен произход и генетични аберации49.Следователно други видове хистология трябва да бъдат включени в моделите за обучение за популационно откриване на рак на белия дроб в скрининговите програми.
Тук идентифицирахме шестте най-често променяни пътища в белодробния аденокарцином в сравнение със здрави контроли и доброкачествени възли.Ксантинът и хипоксантинът са често срещани метаболити на пуриновия метаболитен път.В съответствие с нашите резултати, междинните продукти, свързани с метаболизма на пурин, са значително повишени в серума или тъканите на пациенти с белодробен аденокарцином в сравнение със здрави контроли или пациенти в преинвазивен стадий15,50.Повишените серумни нива на ксантин и хипоксантин могат да отразяват анаболизма, необходим на бързо пролифериращите ракови клетки.Нарушаването на регулацията на глюкозния метаболизъм е добре познат отличителен белег на раковия метаболизъм51.Тук наблюдаваме значително увеличение на пируват и лактат в групата на LA в сравнение с групата на HC и BN, което е в съответствие с предишни доклади за аномалии на гликолитичния път в профилите на серумния метаболом на пациенти с недребноклетъчен рак на белия дроб (NSCLC) и здравословни контроли.резултатите са последователни52,53.
Важно е, че наблюдавахме обратна корелация между метаболизма на пируват и триптофан в серума на белодробни аденокарциноми.Серумните нива на триптофан са намалени в групата на LA в сравнение с групата на HC или BN.Интересното е, че предишно широкомащабно проучване, използващо проспективна кохорта, установи, че ниските нива на циркулиращ триптофан са свързани с повишен риск от рак на белия дроб 54 .Триптофанът е незаменима аминокиселина, която получаваме изцяло от храната.Ние заключаваме, че серумното изчерпване на триптофан при белодробен аденокарцином може да отразява бързото изчерпване на този метаболит.Добре известно е, че крайният продукт на катаболизма на триптофан по кинурениновия път е източникът на de novo синтез на NAD+.Тъй като NAD+ се произвежда основно чрез спасителния път, значението на NAD+ в метаболизма на триптофан за здравето и болестта остава да бъде определено46.Нашият анализ на базата данни TCGA показа, че експресията на триптофан транспортния разтворител транспортер 7A5 (SLC7A5) е значително повишена в белодробен аденокарцином в сравнение с нормалните контроли и е положително корелирана с експресията на гликолитичния ензим GAPDH.Предишни проучвания се фокусираха главно върху ролята на катаболизма на триптофан в потискането на антитуморния имунен отговор 40, 41, 42.Тук ние демонстрираме, че инхибирането на усвояването на триптофан чрез нокдаун на SLC7A5 в ракови клетки на белия дроб води до последващо намаляване на клетъчните нива на NAD и съпътстващо отслабване на гликолитичната активност.В обобщение, нашето изследване предоставя биологична основа за промени в серумния метаболизъм, свързани със злокачествена трансформация на белодробен аденокарцином.
Мутациите на EGFR са най-честите мутации на водача при пациенти с NSCLC.В нашето проучване открихме, че пациентите с мутация на EGFR (n = 41) имат общи метаболомични профили, подобни на пациентите с див тип EGFR (n = 31), въпреки че открихме понижени серумни нива на някои пациенти с мутант на EGFR при пациенти с ацилкарнитин.Установената функция на ацилкарнитините е да транспортират ацилни групи от цитоплазмата в митохондриалната матрица, което води до окисляване на мастни киселини за производство на енергия 55 .В съответствие с нашите констатации, скорошно проучване също така идентифицира подобни метаболомни профили между EGFR мутант и EGFR див тип тумори чрез анализиране на глобалния метаболом на 102 тъканни проби от белодробен аденокарцином50.Интересно е, че съдържанието на ацилкарнитин е открито и в групата с EGFR мутанти.Следователно, дали промените в нивата на ацилкарнитин отразяват метаболитни промени, предизвикани от EGFR и основните молекулярни пътища, може да заслужава допълнително проучване.
В заключение, нашето проучване установява серумен метаболитен класификатор за диференциална диагноза на белодробни възли и предлага работен процес, който може да оптимизира оценката на риска и да улесни клиничното управление въз основа на CT скрининг.
Това проучване е одобрено от Комитета по етика на онкологичната болница на университета Сун Ятсен, Първата свързана болница на университета Сун Ятсен и комитета по етика на онкологичната болница на университета Джънджоу.В групите за откриване и вътрешно валидиране бяха събрани 174 серума от здрави индивиди и 244 серума от доброкачествени възли от лица, подложени на годишни медицински прегледи в Отдела за контрол и превенция на рака, Раковия център на университета Сун Ятсен и 166 доброкачествени възли.серум.Етап I на белодробни аденокарциноми бяха събрани от раковия център на университета Sun Yat-sen.В кохортата за външно валидиране имаше 48 случая на доброкачествени възли, 39 случая на аденокарцином на белия дроб в стадий I от Първата свързана болница на университета Сун Ятсен и 24 случая на аденокарцином на белия дроб в стадий I от болницата за рак на Джънджоу.Раковият център на Университета Сун Ятсен също събра 16 случая на плоскоклетъчен белодробен рак в стадий I, за да тества диагностичната способност на установения метаболитен класификатор (характеристиките на пациента са показани в допълнителна таблица 5).Проби от кохортата за откриване и кохортата за вътрешно валидиране бяха събрани между януари 2018 г. и май 2020 г. Пробите за кохортата за външно валидиране бяха събрани между август 2021 г. и октомври 2022 г. За да се сведе до минимум пристрастието по пол, приблизително равен брой случаи на мъже и жени бяха определени за всеки кохорта.Екип за откриване и екип за вътрешен преглед.Полът на участниците е определен въз основа на самоотчет.Беше получено информирано съгласие от всички участници и не беше предоставена компенсация.Субектите с доброкачествени възли са тези със стабилен резултат от CT сканиране на 2 до 5 години към момента на анализа, с изключение на 1 случай от пробата за външно валидиране, която е събрана предоперативно и диагностицирана чрез хистопатология.С изключение на хроничния бронхит.Случаите на белодробен аденокарцином бяха събрани преди белодробна резекция и потвърдени от патологична диагноза.Кръвни проби на гладно бяха събрани в епруветки за разделяне на серум без никакви антикоагуланти.Кръвните проби се съсирват за 1 час при стайна температура и след това се центрофугират при 2851 × g за 10 минути при 4°C за събиране на серумния супернатант.Серумните аликвоти се замразяват при -80°C до екстракция на метаболита.Отделът за превенция на рака и медицински прегледи на онкологичния център на университета Сун Ятсен събра набор от серум от 100 здрави донори, включително равен брой мъже и жени на възраст от 40 до 55 години.Равни обеми от всяка донорна проба се смесват, полученият пул се разделя на аликвоти и се съхранява при -80°C.Серумната смес се използва като референтен материал за контрол на качеството и стандартизация на данните.
Референтният серум и тестовите проби бяха размразени и метаболитите бяха екстрахирани чрез комбиниран метод на екстракция (MTBE/метанол/вода) 56 .Накратко, 50 μl серум се смесва с 225 μl ледено студен метанол и 750 μl ледено студен метил терт-бутилов етер (MTBE).Разбъркайте сместа и инкубирайте върху лед за 1 час.След това пробите се смесват и се смесват на вортекс със 188 μl вода от клас MS, съдържаща вътрешни стандарти (13C-лактат, 13C3-пируват, 13C-метионин и 13C6-изолевцин, закупени от Cambridge Isotope Laboratories).След това сместа се центрофугира при 15 000 × g за 10 минути при 4 ° С и долната фаза се прехвърля в две епруветки (125 μL всяка) за LC-MS анализ в положителен и отрицателен режим.Накрая, пробата се изпарява до сухо във високоскоростен вакуумен концентратор.
Изсушените метаболити се възстановяват в 120 μl 80% ацетонитрил, разбъркват се на вортекс за 5 минути и се центрофугират при 15 000 × g за 10 минути при 4 ° С.Супернатантите се прехвърлят в кехлибарени стъклени флакони с микровложки за метаболомни изследвания.Нецелеви метаболомичен анализ на платформа с ултра-ефективна течна хроматография с висока разделителна способност (UPLC-HRMS).Метаболитите се разделят с помощта на система Dionex Ultimate 3000 UPLC и колона ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters).В режим на положителни йони подвижните фази бяха 95% (А) и 50% ацетонитрил (В), всяка от които съдържаше 10 mmol/L амониев ацетат и 0,1% мравчена киселина.В отрицателен режим подвижните фази А и В съдържат съответно 95% и 50% ацетонитрил, двете фази съдържат 10 mmol/L амониев ацетат, рН = 9. Градиентната програма е както следва: 0–0,5 минути, 2% В;0,5–12 минути, 2–50% B;12–14 минути, 50–98% B;14-16 минути, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16.1–20 минути, 2% B. Колоната се поддържа при 40°C, а пробата при 10°C в автосамплера.Скоростта на потока е 0.3 ml/min, обемът на инжектиране е 3 μl.Масспектрометър Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) с източник на йонизация с електроразпръскване (ESI) работи в режим на пълно сканиране и се съчетава с режим на наблюдение ddMS2 за събиране на големи обеми данни.Параметрите на MS бяха зададени както следва: напрежение на пръскане +3,8 kV/- 3,2 kV, капилярна температура 320°C, защитен газ 40 arb, спомагателен газ 10 arb, температура на нагревателя на сондата 350°C, обхват на сканиране 70–1050 m/h, резолюция.70 000. Данните са получени с помощта на Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
За да се оцени качеството на данните, бяха генерирани сборни проби за контрол на качеството (QC) чрез отстраняване на 10 μL аликвоти от супернатантата от всяка проба.В началото на аналитичната последователност бяха анализирани шест инжекции на проби за контрол на качеството, за да се оцени стабилността на системата UPLC-MS.След това в партидата периодично се въвеждат проби за контрол на качеството.Всички 11 партиди серумни проби в това изследване бяха анализирани чрез LC-MS.Аликвотни части от смес от серумен пул от 100 здрави донори бяха използвани като референтен материал в съответните партиди за наблюдение на процеса на екстракция и коригиране на ефектите от партида към партида.Нецелевият метаболомичен анализ на кохортата за откриване, кохортата за вътрешно валидиране и кохортата за външно валидиране беше извършен в Метаболомичния център на университета Сун Ятсен.Външната лаборатория на Центъра за анализ и тестване на технологичния университет в Гуандун също анализира 40 проби от външната кохорта, за да тества ефективността на модела на класификатора.
След екстракция и разтваряне, абсолютното количествено определяне на серумните метаболити беше измерено с помощта на ултрависоко ефективна течна хроматография-тандемна масспектрометрия (Agilent 6495 троен квадрупол) с източник на йонизация с електроспрей (ESI) в режим на наблюдение на множество реакции (MRM).Колона ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) се използва за разделяне на метаболитите.Подвижната фаза се състои от 90% (А) и 5% ацетонитрил (В) с 10 mmol/L амониев ацетат и 0,1% разтвор на амоняк.Програмата за градиент беше както следва: 0–1,5 минути, 0% B;1,5–6,5 минути, 0–15% B;6,5–8 минути, 15% B;8–8,5 минути, 15%–0% B;8,5–11,5 минути, 0%B.Колоната се поддържа при 40 °C, а пробата при 10 °C в автосамплера.Скоростта на потока беше 0,3 mL/min и инжекционният обем беше 1 μL.Параметрите на MS бяха зададени както следва: капилярно напрежение ±3.5 kV, налягане на пулверизатора 35 psi, поток на обвивния газ 12 L/min, температура на обвивния газ 350°C, температура на изсушаващия газ 250°C и поток на изсушаващ газ 14 l/min.Конверсиите на MRM на триптофан, пируват, лактат, хипоксантин и ксантин са 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 и 151.0–107.9 съответно.Данните бяха събрани с помощта на Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).За серумни проби триптофанът, пируватът, лактатът, хипоксантинът и ксантинът се определят количествено с помощта на калибрационни криви на стандартни смесени разтвори.За клетъчни проби съдържанието на триптофан се нормализира спрямо вътрешния стандарт и масата на клетъчния протеин.
Пикова екстракция (m/z и време на задържане (RT)) се извършва с помощта на Compound Discovery 3.1 и TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).За да се елиминират потенциалните разлики между партидите, всеки характерен пик на тестовата проба беше разделен на характерния пик на референтния материал от същата партида, за да се получи относителното изобилие.Относителните стандартни отклонения на вътрешните стандарти преди и след стандартизацията са показани в допълнителна таблица 6. Разликите между двете групи се характеризират с процент на фалшиви открития (FDR<0,05, Wilcoxon signed rank test) и промяна на пъти (>1,2 или <0,83).Суровите MS данни на извлечените характеристики и референтните серум-коригирани MS данни са показани съответно в Допълнителни данни 1 и Допълнителни данни 2.Пиковата анотация беше извършена въз основа на четири дефинирани нива на идентификация, включително идентифицирани метаболити, предполагаемо анотирани съединения, предполагаемо характеризирани класове съединения и неизвестни съединения 22 .Въз основа на търсения в базата данни в Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), биологични съединения с MS/MS, съответстващи на валидирани стандарти или анотации за точно съвпадение в mzCloud (резултат > 85) или Chemspider, накрая бяха избрани като междинни продукти между диференциалния метаболом.Пиковите пояснения за всяка характеристика са включени в Допълнителни данни 3. MetaboAnalyst 5.0 беше използван за едномерен анализ на сумарно нормализирано метаболитно изобилие.MetaboAnalyst 5.0 също оцени анализа на обогатяването на пътя на KEGG въз основа на значително различни метаболити.Анализът на главните компоненти (PCA) и дискриминантният анализ на частични най-малки квадрати (PLS-DA) бяха анализирани с помощта на софтуерния пакет ropls (v.1.26.4) с нормализиране на стека и автоматично мащабиране.Оптималният метаболитен биомаркерен модел за предсказване на злокачествено заболяване на възли беше генериран с помощта на бинарна логистична регресия с най-малко абсолютно свиване и оператор за селекция (LASSO, R пакет v.4.1-3).Ефективността на дискриминантния модел в комплектите за откриване и валидиране се характеризира чрез оценка на AUC въз основа на ROC анализ съгласно pROC пакета (v.1.18.0.).Оптималната граница на вероятността е получена въз основа на максималния индекс на Youden на модела (чувствителност + специфичност – 1).Проби със стойности по-малки или по-високи от прага ще бъдат предсказани съответно като доброкачествени възли и белодробен аденокарцином.
A549 клетки (#CCL-185, Американска колекция от типови култури) се отглеждат в F-12K среда, съдържаща 10% FBS.Къси фиби РНК (shRNA) последователности, насочени към SLC7A5 и ненасочена контрола (NC), бяха вмъкнати в лентивирусния вектор pLKO.1-puro.Антисенс последователностите на shSLC7A5 са както следва: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Антитела срещу SLC7A5 (#5347) и тубулин (#2148) са закупени от Cell Signaling Technology.Антитела срещу SLC7A5 и тубулин се използват при разреждане 1:1000 за Western blot анализ.
Тестът за гликолитичен стрес Seahorse XF измерва нивата на извънклетъчно подкисляване (ECAR).В анализа глюкоза, олигомицин А и 2-DG се прилагат последователно за тестване на клетъчния гликолитичен капацитет, измерен чрез ECAR.
A549 клетки, трансфектирани с нецелева контрола (NC) и shSLC7A5 (Sh1, Sh2), се поставят за една нощ в блюда с диаметър 10 cm.Клетъчните метаболити се екстрахират с 1 ml ледено студен 80% воден метанол.Клетките в метаноловия разтвор се изстъргват, събират се в нова епруветка и се центрофугират при 15 000 × g за 15 минути при 4 ° С.Съберете 800 µl от супернатантата и изсушете с помощта на високоскоростен вакуумен концентратор.След това изсушените метаболитни пелети се анализират за нива на триптофан с помощта на LC-MS/MS, както е описано по-горе.Клетъчните нива на NAD(H) в A549 клетки (NC и shSLC7A5) бяха измерени с помощта на количествен NAD+/NADH колориметричен комплект (#K337, BioVision) съгласно инструкциите на производителя.Нивата на протеин се измерват за всяка проба, за да се нормализира количеството на метаболитите.
Не са използвани статистически методи за предварително определяне на размера на извадката.Предишни метаболомични проучвания, насочени към откриване на биомаркери 15, 18, се считат за еталони за определяне на размера и в сравнение с тези доклади, нашата извадка беше адекватна.Не бяха изключени проби от кохортата на изследването.Серумните проби бяха разпределени на случаен принцип към група за откриване (306 случая, 74,6%) и група за вътрешно валидиране (104 случая, 25,4%) за нецелеви метаболомични изследвания.Ние също произволно избрахме 70 случая от всяка група от набора за открития за целенасочени метаболомични изследвания.Изследователите бяха заслепени за разпределяне на групи по време на събирането и анализа на данни LC-MS.Статистическите анализи на метаболомичните данни и клетъчните експерименти са описани в съответните раздели за резултати, легенди на фигури и методи.Количественото определяне на клетъчния триптофан, NADT и гликолитичната активност се извършва три пъти независимо с идентични резултати.
За повече информация относно дизайна на изследването вижте резюмето на отчета за естествено портфолио, свързано с тази статия.
Суровите MS данни на извлечените характеристики и нормализираните MS данни на референтния серум са показани съответно в Допълнителни данни 1 и Допълнителни данни 2.Пиковите анотации за диференциални характеристики са представени в допълнителни данни 3. Наборът от данни LUAD TCGA може да бъде изтеглен от https://portal.gdc.cancer.gov/.Входните данни за начертаване на графиката са предоставени в изходните данни.За тази статия са предоставени изходни данни.
Национална изследователска група за скрининг на белия дроб и др. Намаляване на смъртността от рак на белия дроб с компютърна томография с ниска доза.Северна Англия.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR и Prophet, PC Скрининг на рак на белия дроб с използване на ниска доза спирална CT: резултати от Националното проучване за скрининг на белите дробове (NLST).J. Med.Екран 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ и др.Намаляване на смъртността от рак на белия дроб с обемен CT скрининг в рандомизирано проучване.Северна Англия.J. Med.382, 503–513 (2020).
Време на публикуване: 18 септември 2023 г